Транспортер это: ТРАНСПОРТЕР — это… Что такое ТРАНСПОРТЕР?

Эксперимент по прорастанию пыльцы in vitro проводили, как описано ⁵² с небольшими изменениями.Для WT и gtr1 цветки стадии 14 случайным образом собирали с восьми растений каждое. Затем для каждого эксперимента пыльцевые зерна получали от трех отдельных цветков. Среда для прорастания пыльцы содержала 5 мМ MES-Tris (pH 5,8), 1 мМ KCl, 0,8 мМ MgSO ₄ , 1,5 мМ борную кислоту, 10 мМ CaCl ₂ , 16% (мас. / Об.) Сахарозы и 0,5% (w / v) INA-агар. Прорастание пыльцы наблюдали под микроскопом после 24 ч инкубации при 23 ° C в непрерывном свете (30 мкмоль м ^-2 с ^-1 ) с высокой влажностью, и подсчитывали количество проросших пыльцевых зерен.

Количественная оценка гормонов растений

Стадии развития цветков были такими, как описано ³⁵ . Цветы были разделены на три стадии (12–14) и собирались каждые 3 дня с 4-6-недельных растений, выращенных на почве. Образцы цветов (~ 500 мг свежей массы на этап) замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C. Замороженные образцы из WT и gtr1 лиофилизировали, и GA экстрагировали из образцов с использованием 80% (об. / Об.) Ацетона, содержащего 1% (об. / Об.) Уксусной кислоты, как описано ⁵³ .Вкратце, лиофилизированные растительные материалы (12–28 мг сухого веса) измельчали ​​в 80% (об. / Об.) Ацетоне, содержащем 1% (об. / Об.) Уксусной кислоты с [17,17- ² H ₂ ] GA ( 300 пг каждый) в качестве внутренних стандартов. Неочищенный экстракт очищали с помощью картриджей с поливинилпирролидоном (500 мг; Tokyo Kasei) и с обращенной фазой (Oasis HLB, 60 мг; Waters). Фракцию, содержащую GA, дополнительно очищали с помощью ионообменной колонки (Bond Elut DEA, 100 мг; Agilent) и картриджа с силикагелем SepPak (100 мг; Waters). Полученную фракцию, обогащенную GA, концентрировали досуха, растворяли в 20 мкл воды, содержащей 1% уксусную кислоту, и затем подвергали анализу масс-спектрометрии LC-тандем (LC-MS / MS).

GA были определены количественно, как описано ⁵³ с некоторыми модификациями. ЖХ проводили с колонкой Acquity UPLC HSS T3 (1,8 мкм, 2,1 × 50 мм; Waters, MA, USA) с использованием следующей программы с растворителем A (вода, содержащая 0,01% (об. / Об.) Уксусной кислоты) и растворителем B (ацетонитрил). содержащий 0,05% (об. / об.) уксусной кислоты): изократический поток с 3% B в течение 30 с, линейный градиент B от 3 до 12% в течение 2,5 минут, линейный градиент B от 12 до 25% в течение 5 минут, линейный градиент B от 25 до 40% в течение 4 минут, изократический поток с 40% B в течение 2 минут, линейный градиент B от 40 до 98% в течение 1 минуты и изократическое элюирование с 98% B в течение 1 минуты.Условия МС / МС были следующими: плавающее напряжение ионного распыления (кВ) = — 4,0, температура десольватации = 600 ° C, энергия столкновения (В) = — 40 (GA ₁ ) или -30 (GA ₄ ), потенциал декластеризации = -90, переход МС / МС ( м / z ): 349,2 / 275,2 ([ ² H ₂ ] GA1), 347,2 / 273,2 (GA ₁ ), 333,2 / 259,2 ( [ ² H ₂ ] GA ₄ ), 331,2 / 257,2 (GA ₄ ). Время удерживания LC составляло 5,5 мин для GA ₁ и 11.5 мин для GA ₄ .

Транспортер ASCT1 (Slc1a4) является физиологическим регулятором d-серина и развития нервной системы головного мозга

Значение

d-серин регулирует синаптическую пластичность и поведение путем связывания с рецепторами NMDA. Перекрестное взаимодействие астроцитов и нейронов обеспечивает l-серин для синтеза d-серина в процессе, называемом сериновым челноком. Мы показываем, что нейтральный аминокислотный антипортер ASCT1 может высвобождать l-серин из астроцитов в обмен на d-серин и другие аминокислотные субстраты.Мыши, у которых отсутствует ASCT1, но не паралогичный ASCT2, демонстрируют измененные уровни в мозге l-серина, d-серина, l-аланина, l-треонина и глицина. Делеция ASCT1 была связана с уменьшением объема различных областей мозга, измененной экспрессией генов, а также с моторным и обучающим дефицитом. Наше исследование проливает свет на роль ASCT1 в метаболизме мозга с последствиями для патофизиологии нарушений развития нервной системы, наблюдаемых у пациентов с мутациями в гене ASCT1.

Abstract

d-серин является физиологическим коагонистом рецепторов NMDA, но мало что известно о регуляции его синтеза и синаптического обмена.Аминокислотные обменники ASCT1 (Slc1a4) и ASCT2 (Slc1a5) являются кандидатами на регулирование уровней d-серина. Используя мышей ASCT1 и ASCT2 KO, мы сообщаем, что ASCT1, а не ASCT2, является физиологическим регулятором метаболизма d-серина. ASCT1 является основной системой захвата d-серина в астроцитах и ​​может также экспортировать l-серин через гетерообмен, снабжая нейроны субстратом для синтеза d-серина. Мыши ASCT1-KO демонстрируют более низкие уровни d-серина в головном мозге наряду с более высокими уровнями l-аланина, l-треонина и глицина.Делеция ASCT1 была связана с нарушениями развития нервной системы, включая уменьшение объемов гиппокампа и полосатого тела, а также изменения экспрессии генов, связанных с развитием нервной системы. Кроме того, мыши ASCT1-KO проявляли дефицит двигательной функции, пространственного обучения и аффективного поведения, наряду с изменениями относительного вклада d-серина по сравнению с глицином в опосредование активности рецепторов NMDA. Микродиализ in vivo продемонстрировал более низкие уровни внеклеточного d-серина у мышей ASCT1-KO, подтверждая измененный метаболизм d-серина.Эти изменения напоминают некоторые фенотипы развития нервной системы у пациентов с мутациями ASCT1. Мыши ASCT1-KO представляют собой полезную модель для потенциальных терапевтических вмешательств, направленных на коррекцию метаболических нарушений у пациентов с мутациями ASCT1.

NMDA-рецепторы (NMDAR) играют ключевую роль в развитии нервной системы, синаптической пластичности, обучении и памяти (1). В отличие от других рецепторов нейротрансмиттеров, NMDAR требует связывания коагониста (d-серина или глицина) в дополнение к глутамату (1).d-серин синтезируется из l-серина сериновой рацемазой (SR) (2). Мыши SR-KO обнаруживают снижение уровня d-серина в головном мозге на 90% и обнаруживают нарушения NMDAR-зависимой синаптической пластичности (3-5). Однако механизмы, регулирующие метаболизм d-серина в переднем мозге, остаются неизвестными. В ранних исследованиях сообщалось об исключительной астроцитарной локализации d-серина (6), что привело к предположению, что d-серин является глиотрансмиттером. Однако недавние исследования с использованием более селективных антител и SR-KO в качестве контроля показывают, что SR преимущественно экспрессируется нейронами (7-9).В соответствии с этим, избирательная делеция SR из нейронов снижает синаптическую пластичность в синапсах гиппокампа коллатерального CA1 Шаффера как in vitro, так и in vivo (5, 9).

L-серин мозга синтезируется из глюкозы с помощью ряда ферментов, включая 3-фосфоглицератдегидрогеназу (3PGDH), которая экспрессируется исключительно в астроглии. Избирательная астроцитами делеция 3PGDH у мышей сильно снижает уровни нейронального d-серина (8). Эти данные привели нас к предложению метаболического перекрестного взаимодействия астроцитов и нейронов, называемого сериновым челноком, посредством которого l-серин, синтезируемый в астроцитах, перемещается к нейронам и поддерживает синтез d-серина (10).

Обмениватели аланина, серина, цистеина и треонина ASCT1 (SLC1a4) и ASCT2 (SLC1a5) транспортируют d-серин в трансфицированных клетках HEK293 (11). ASCT2 имеет более широкую субстратную селективность, действуя также на глутамин (12). Однако их значимость для транспорта d-серина или других аминокислот мозга in vivo не оценивалась.

Для идентификации транспортеров l- и d-серина в астроцитах и ​​изучения их роли in vivo мы исследовали мышей ASCT1-KO и ASCT2-KO. Мы обнаружили, что ASCT1, а не ASCT2, является компонентом серинового челнока мозга.Мыши ASCT1-KO обнаруживают двигательные нарушения и нарушения развития нервной системы, напоминающие миссенс-мутации ASCT1 у людей. Данные указывают на роль ASCT1 в метаболическом взаимодействии астроглии и нейронов и развитии нервной системы.

Результаты

Роль ASCT1 и ASCT2 в транспорте аминокислот.

Мы создали колонии мышей ASCT1-KO и ASCT2-KO и изучили их роль в транспорте аминокислот в головном мозге. Гомозиготы ASCT1-KO и ASCT2-KO жизнеспособны и плодовиты. У мышей ASCT1-KO не было обнаруживаемого белка ASCT1 в головном мозге ( SI Приложение , рис.S1). Поскольку экспрессия ASCT2 в головном мозге ниже аффинности нашего антитела, мы подтвердили отсутствие критических экзонов ASCT2 в мозге мышей ASCT2-KO с помощью ПЦР, наряду с отсутствием экспрессии белка в почках, где ASCT2 высоко экспрессируется. ( SI Приложение , рис. S1).

Мы наблюдали снижение на 80–90% транспорта d-серина и l-серина в культивируемых астроцитах мышей ASCT1-KO (рис. 1 A и B ). Транспортировка типичных субстратов ASCT1 (например,g., l-аланин и l-треонин) также значительно снизился (рис. 1 C и D ). Кроме того, транспорт глицина астроцитами ASCT1-KO был на 40% ниже, чем WT (фиг. 1 E ), в то время как поглощение глутамата не изменилось (фиг. 1 F ).

Транспорт аминокислот астроглией мышей ASCT1-KO и ASCT2-KO. ( A — H ) Поглощение аминокислот в первичных культурах астроцитов мышей WT и ASCT1-KO, проведенное в забуференном Hepes физиологическом растворе (HBSS) с добавлением 10 мкМ d- [ ³ H] серина ( A ), l- [ ³ H] серин ( B ), l- [ ¹⁴ C] аланин ( C ), l- [ ³ H] треонин ( D ), [ ³ H] глицин, ( E ) или 1- [ ³ H] глутамат ( F ).( G и H ) Поглощение 10 мкМ d- [ ³ H] серина ( G ) или [ ³ H] глицина ( F ) измеряли в HBSS с добавлением 14 мкМ аланина. , 36 мкМ l-серина, 2 мкМ цистеина и 18 мкМ треонина (A, S, C, T). ( I — L ) Поглощение аминокислот в первичных культурах астроцитов мышей WT и ASCT2-KO в HBSS с добавлением 10 мкМ d- [ ³ H] серина ( I ), l- [ ³ H] серин ( J ), 1- [ ³ H] глутамин ( K ) или 1- [ ³ H] глутамат ( L ).Результаты представляют собой среднее значение ± SEM от четырех до семи экспериментов с различными препаратами астроглии. Отличается от контроля при *** P <0,001, ** 0,01 и * 0,05 (парный двусторонний тест Стьюдента t ). нс, разница несущественная.

В физиологических условиях другие внеклеточные аминокислотные субстраты могут связываться с ASCT1 с высоким сродством и предотвращать транспорт d-серина. Поэтому мы протестировали поглощение d- [ ³ H] серина в присутствии типичных внеклеточных концентраций субстратов ASCT1 [14 мкМ l-аланина, 36 мкМ l-серина, 2 мкМ l-цистеина и 18 мкМ l- треонин (13)].В этих условиях ASCT1 все еще транспортирует d-серин (Fig. 1 G ). Напротив, ASCT1-зависимое поглощение глицина не было обнаружено в присутствии других субстратов ASCT1 (рис. 1 H ), что позволяет предположить, что глицин является плохим субстратом ASCT1.

Однако поглощение d-серина, l-серина, l-глутамина и l-глутамата не изменилось в первичных культурах астроцитов мышей ASCT2-KO (рис. 1 I — L ).

В корковых синаптосомах, состоящих из смеси нейрональных и глиальных частиц, мы обнаружили на 30% меньшее поглощение l-серина и d-серина в препаратах от мышей ASCT1-KO (рис.2 A и B ), процент, который представляет собой предполагаемое глиальное загрязнение в синаптосомном препарате (14). Мы также отслеживали эффект транс, -4-гидрокси-1-пролина (OH-Pro), селективного субстрата ASCT1, который конкурирует с другими субстратами (15). В соответствии с этим, OH-Pro ингибировал транспорт d-серина в HEK293, трансфицированном ASCT1, в той же степени, что и избыток l-аланина ( SI, приложение , рис. S2 A ). OH-Pro не влиял на ASCT2 или транспортер d-серина Asc-1 ( SI, приложение , рис.S2 B и C ). OH-Pro ингибировал захват d-серина (фиг. 2 B ) и l-серина (фиг. 2 A ) синаптосомами WT, но не влиял на препараты из ASCT1-KO. В отличие от ASCT1, поглощение типичных субстратов ASCT2 (например, глутамина, l-серина и d-серина) не затрагивалось в синаптосомах, полученных из мышей ASCT2-KO (рис. 2 D ).

Поглощение аминокислот в синаптосомах мышей ASCT1-KO и ASCT2-KO и изменения аминокислот в мозге.( A — C ) Поглощение аминокислот синаптосомами мышей WT и ASCT1-KO, отслеживаемых в HBSS с добавлением 1 мкМ d- [ ³ H] серина ( A ), l- [ ³ H ] серин ( B ) или 1- [ ³ H] глутамат ( C ) либо в отсутствие, либо в присутствии 1 мМ OH-Pro. ( D ) Поглощение аминокислот в синаптосомах мышей WT и ASCT2-KO. ( E ) Уровни аминокислот в цельном мозге мышей P4 WT ( n = 10) и ASCT1-KO ( n = 11).Результаты представляют собой среднее значение ± SEM четырех ( A и B ), пяти ( D ) и семи ( C ) экспериментов с различными препаратами. Отличается от контроля при *** P <0,001, ** 0,01 и * 0,05. n.s., разница незначительна. Повторные измерения одностороннего дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Тьюки ( A — C ) или двусторонним тестом Стьюдента t ( D и E ).

Аминокислоты мозга у мышей ASCT1-KO.

Мы измерили уровни субстратов ASCT1 и ASCT2 в мозге соответствующих мышей KO и однопометников WT в разном возрасте. В мозге 4-дневных (P4) мышей ASCT1-KO обнаружено снижение уровней l- и d-серина на 20 и 25% соответственно (рис. 2 E ). Уровни глицина, l-треонина и l-аланина были на 60-40% выше у мышей ASCT1-KO, чем у мышей WT (рис. 2 E ). Небольшое снижение уровня l-глутамата мозга на 7% было также обнаружено у мышей ASCT1-KO. Примечательно, что соотношение между двумя коагонистами NMDAR (глицин / d-серин) в мозге мышей ASCT1-KO было почти вдвое больше, чем у мышей WT (1.9-кратное увеличение, P <0,001, непарный тест Стьюдента t ), что указывает на значительное увеличение общего глицина в головном мозге по сравнению с d-серином.

Сывороточные уровни l-треонина у детенышей мышей P4 ASCT1-KO в два раза превышали значения WT ( SI, приложение , рис. S3 D ). Однако, за исключением этой незаменимой аминокислоты, сывороточные уровни других аминокислот у мышей P4 не коррелировали с их уровнями в мозге (сравните Рис.2 E и SI Приложение , Рис.S3 D ). Снижение уровней d-серина вместе с увеличением глицина, l-аланина и треонина сохранялось в некоторых областях мозга взрослых мышей ASCT1-KO ( SI, приложение , рис. S3 A — C ), тогда как их сывороточные аминокислоты не изменились ( SI Приложение , рис. S3 E ). Следовательно, изменения в развитии аминокислот мозга, наблюдаемые у мышей ASCT1-KO, обусловлены внутренними изменениями метаболизма мозга, не связанными с уровнями аминокислот в сыворотке.

Уровни различных сфинголипидов, производных l-серина, в коре головного мозга и полосатом теле у мышей ASCT1-KO не были изменены ( SI Приложение , рис. S3 F и G ), что позволяет предположить, что поступление l- У взрослых мышей практически не влияло на синтез серина липидов.

Однако мыши ASCT2-KO имели нормальные уровни аминокислот в мозге ( SI, приложение , рис. S4), что дополнительно указывает на то, что этот переносчик не влияет на метаболизм аминокислот в мозге мыши в нормальных условиях.Поэтому в последующих экспериментах мы сосредоточились на исследовании роли его паралога ASCT1.

Астроглиальные локализации ASCT1.

Экспрессия ASCT1 была продемонстрирована либо в астроцитах (16), либо преимущественно в нейронах (17). Чтобы определить локализацию ASCT1, мы провели иммуногистохимию с использованием мышей ASCT1-KO в качестве отрицательного контроля, чтобы гарантировать специфичность антител. Мы обнаружили, что ASCT1 колокализуется с астроцитарным маркером 3PGDH в коре головного мозга, области CA1 гиппокампа и зубчатой ​​извилине (рис.3 А ). Иммунофлуоресценция была отменена у мышей ASCT1-KO (фиг. 3 B ). Эксперименты по тройной иммунофлуоресценции показали отсутствие совместной локализации ASCT1 с клетками, экспрессирующими нейрональный маркер MAP2 (фиг. 3 C ). При большом увеличении пунктированная иммунореактивность ASCT1 наблюдается в телах клеток и астроглиальных отростках, где он колокализуется с 3PHGDH (рис. 3 C ). Данные показывают, что ASCT1 в основном является переносчиком астроцитов у взрослых мышей.

Астроглиальная локализация ASCT1 у взрослых мышей. ( A ) Белок ASCT1 (красный) колокализуется с астроцитарным маркером 3PGDH (зеленый) у мышей WT, но не с нейрональным маркером белка, ассоциированного с микротрубочками 2 (MAP2). ( B ) Отсутствие иммунореактивности ASCT1 у мышей ASCT1-KO. ( C ) Большое увеличение кортикального астроцита, показывающего пунктированную иммунореактивность для ASCT1, который колокализуется с 3PGDH, но отсутствует в MAP2-экспрессирующих клетках. СА1, СА1 подполе гиппокампа; Сх, неокортекс; ДГ — зубчатая извилина; gr — гранулярные клетки; пи, пирамидальная ячейка.(Шкала 10 мкм.)

Роль ASCT1 в нервном развитии.

Мутации в ASCT1 вызывают микроцефалию у человека (18, 19). Используя МРТ, мы обнаружили значительное уменьшение объемов гиппокампа и полосатого тела мышей ASCT1-KO, что указывает на то, что они повторяют некоторые изменения, наблюдаемые у людей (рис. 4). Результаты полуавтоматического анализа были подтверждены ручным анализом гиппокампа ( SI Приложение , рис. S5). Никаких различий в объемах в неокортексе, коре мозжечка и в целом головном мозге не наблюдалось (рис.4 В ).

Объемы областей мозга и экспрессия генов у мышей ASCT1-KO. ( A ) Маскирование гиппокампа (красный) на среднем МРТ-сканировании населения дикого типа. ( B ) Общий объем мозга и субрегионов мышей WT соответствующего возраста 9–11 месяцев ( n = 12) и ASCT1-KO ( n = 12) мышей. ( C и D ) Графики разницы дельты (Log2) в экспрессии генов между мышами WT и ASCT1-KO (ось y ) и средних нормированных значений (ось x ), генерируемых в полосатом теле и неокортексе.Дифференциально экспрессируемые гены обозначены красными символами. ( E ) Анализ обогащения в метагруппах дифференциально экспрессируемых генов в полосатом теле мышей WT и ASCT1-KO в соответствии с биологическими процессами Gene Ontology, анализируемыми с помощью неизбыточной реципрокной связи генов и биологических терминов. На оси и показаны скорректированные значения P . Отличается от контроля при *** P <0,001 и ** 0,01. n.s., разница незначительна. Непарный двусторонний тест Стьюдента t ( B ).

Затем мы провели секвенирование РНК полосатого тела, которое было изменено при МРТ-анализе, и сравнили его с неокортексом, который не был затронут. Мы обнаружили значительные изменения в 375 транскриптах в полосатом теле взрослых мышей при скорректированных значениях P ниже 0,05 (рис. 4 C и набор данных S1). Никаких изменений в экспрессии генов в неокортексе не наблюдалось (рис. 4 D ). В полосатом теле анализ обогащения с использованием неизбыточного реципрокного сцепления генов выявил 11 метагрупп, при этом преобладание генов, связанных с ведением аксонов и развитием нервной системы (рис.4 E и набор данных S2). Все метагруппы имели ширину силуэта> 0,5 (набор данных S2), что указывает на высокую степень внутренней герметичности и удаленности от других метагрупп (20). Наиболее значительные изменения были замечены в генах управления аксонами (рис. 4 E ), что свидетельствует об изменениях. в транскриптах генов, связанных с развитием нервной системы, у мышей ASCT1-KO.

Изменения поведения у мышей ASCT1-KO.

Мы наблюдали за двигательной функцией детенышей мышей на Р8, чтобы оценить раннюю дисфункцию. Паттерн передвижения мышей ASCT1-KO был таким же, как и у мышей WT, оба демонстрировали медленное ползание и некоторые асимметричные движения конечностей (рис.5 А ). Однако мыши ASCT1-KO демонстрировали замедленную реакцию выпрямления, когда их помещали на спину (фиг. 5 B ). При размещении на железной сетке, которую постепенно переворачивали, мыши ASCT1-KO падали под меньшими углами, что свидетельствует о более слабой силе захвата в четырех конечностях (рис. 5 C ). При подвешивании за задние лапы за край конической трубки детеныши мышей ASCT1-KO демонстрировали нормальную позу (рис. 5 D ), но демонстрировали более короткую задержку падения, что свидетельствует о более слабой силе задних конечностей (рис.5 E ).

Поведенческая характеристика мышей ASCT1-KO. ( A ) Оценка передвижения детенышей мышей P8 WT ( n = 42) и ASCT1-KO ( n = 19). ( B ) Время восстановления показывает большую задержку времени у мышей ASCT1-KO ( n = 19) по сравнению с мышами WT ( n = 42) P8 (** P <0,01). ( C ) Мыши ASCT1-KO ( n = 19) демонстрируют более слабый захват, чем WT ( n = 23) мыши P8 (** P <0.01). ( D ) Оценка подвешивания задних конечностей у мышей ASCT1-KO ( n = 19) и WT ( n = 42) мышей P8. ( E ) Мыши ASCT1-KO ( n = 19) демонстрируют более короткую задержку падения в тесте подвешивания задних конечностей по сравнению с мышами WT ( n = 42) P8 (*** P <0,001). ( F ) Снижение активности открытого поля у 4-месячных мышей ASCT1-KO (** P <0,01). ( G ) Характеристики стержня ротора мышей WT и ASCT1-KO (* P <0.05). ( H ) В задаче водного лабиринта Морриса мыши ASCT1-KO достигли платформы через более длительные периоды времени на 2 и 3 дни (** P <0,01), но достигли той же производительности, что и WT на 4 день. извлечение путем возврата платформы и воздействия на мышей одного и того же контекста на 50 и 51 день показывает идентичную производительность между мышами WT и ASCT1-KO. Пространственное обращение, проведенное на 52-54 дни, выявило значительно более длительную латентность у мышей ASCT1-KO (* P <0,05, ** P <0.01). ( I ) Мыши ASCT1-KO демонстрировали более медленное плавание в первые 3 дня фазы пространственного захвата, но не во время пространственного обращения (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001). Экспериментальные группы в F — I состояли из 4-5-месячных мышей-самцов (по 12 мышей в каждой группе). ( A — E ) Двусторонний тест Манна – Уитни U ; ( F — I ) непарный двусторонний тест Стьюдента t .

Взрослые мыши ASCT1-KO демонстрируют некоторую степень двигательной дисфункции наряду с нарушениями в обучении и аффективной сфере. Взрослые мыши ASCT1-KO проявляли более низкую активность в открытом поле, но без значительных изменений во времени замораживания или попадании в центр (фиг. 5 F ). Мыши ASCT1-KO имели на 25% меньшую латентность падения со стержня ротора в первый день, что указывает на незначительное нарушение сенсомоторной координации, хотя они достигли такой же латентности, как у WT в последующих тестах (рис. 5 G ).При пространственном обучении с использованием водного лабиринта Морриса мышам ASCT1-KO потребовалось больше времени, чтобы узнать местоположение платформы (рис. 5 H , пространственное обнаружение). Однако после формирования сохранение пространственной памяти в ASCT1-KO было таким же, как и у мышей WT, что наблюдалось в испытании зонда ( SI Приложение , рис. S6 A и B ) и тесте восстановления памяти ( Рис.5 H ). Однако у мышей ASCT1-KO было значительно нарушено обращение пространственного обучения при изменении положения платформы (рис.5 H , пространственный разворот), что указывает на нарушение гибкости обучения. Скорость плавания взрослых мышей ASCT1-KO была на 25% ниже, чем у WT, что указывает на возможное нарушение моторики (рис. 5 I ). Однако низкая скорость плавания сама по себе не объясняет дефицит обучения. В день 1, несмотря на разницу в скорости плавания, мыши WT и ASCT1-KO достигли спасательной платформы после аналогичной задержки (рис. 5 H и I ). Кроме того, плавание мышей ASCT1-KO улучшилось в последующих испытаниях и было идентично плаванию мышей WT во время теста пространственного обращения (рис.5 I ).

Зависимое от миндалевидного тела обучение страху, отслеживаемое с помощью теста активного двустороннего избегания, было нормальным у мышей ASCT1-KO ( SI Приложение , рис. S6 C ). Мыши ASCT1-KO демонстрировали 60% увеличение реакции испуга, которая, как известно, усиливается при тревоге ( SI, приложение , рис. S6 D ). Однако у мышей ASCT1-KO не было обнаружено изменений в предымпульсном ингибировании ( SI Приложение , рис. S6 E ), что указывает на интактное сенсомоторное управление.Тест предпочтения сахарозы показал снижение предпочтения через 72 часа ( SI, приложение , рис. S6 F ), но нормальное потребление жидкости ( SI, приложение , рис. S6 G ).

Синаптическая активность у мышей ASCT1-KO.

Долговременная потенциация (LTP) в синапсах Schaffer collateral-CA1 гиппокампа была нормальной у мышей ASCT1-KO ( SI Приложение , рис. S7 A ). LTP у животных WT не изменялся при добавлении субстрата ASCT1 OH-Pro ( SI, приложение , рис.S7 B ). Длительная депрессия, вызванная низкочастотной стимуляцией, была нормальной у мышей ASCT1-KO ( SI, приложение , рис.S7 C ). Не было обнаружено никаких изменений в базальной нейротрансмиссии или изолированных потенциалах NMDAR ( SI Приложение , рис. S7 D и E ).

В свете их нормальной активности NMDAR, мы задались вопросом, могут ли более высокие уровни глицина в мозге у мышей ASCT1-KO компенсировать снижение d-серина (рис.2 E и SI, приложение , рис.S3 A — C ). Чтобы исследовать эту возможность, мы обработали срезы гиппокампа мышей WT и ASCT1-KO ферментом глициноксидазой (GO) для удаления глицина (6). Для повышения чувствительности метода мы использовали в 6-7 раз более низкое содержание ГО (в единицах активности), чем в предыдущих отчетах (6, 21). Использование ограниченного количества ГО позволяет только частичное удаление эндогенного глицина. В этом случае обработка GO, вероятно, будет менее эффективной для образцов, показывающих более высокие уровни глицина или повышенное высвобождение глицина.Мы обнаружили, что обработка низким титром ГО снижает экспрессию NMDAR-зависимого LTP от мышей WT почти на 50% ( SI, приложение , рис. S7 F ). На LTP в срезах мышей ASCT1-KO не влияла обработка низким титром ГО ( SI Приложение , рис. S7 G ), что позволяет предположить, что их более высокие уровни глицина могут превосходить ферментативную способность ГО. Кроме того, мы также отслеживали эффект ингибитора транспортера глицина 1 ALX 5407, который, как известно, увеличивает синаптический глицин (1).ALX 5407 увеличивал изолированные потенциалы NMDAR мышей WT и ASCT1-KO ( SI, приложение , рис. S7 H ). Однако степень стимуляции ALX 5407 была немного ниже в срезах от мышей ASCT1-KO по сравнению с контрольными животными WT ( SI Приложение , рис. S7 H ), что указывает на то, что NMDAR от ASCT1-KO могут быть немного более насыщенными глицин. Мы также исследовали клетки места в области CA1 мышей с помощью электрофизиологии in vivo, которая показала, что их активность сохраняется у мышей ASCT1-KO, за исключением значительных изменений ( SI, приложение , рис.S8).

Аминокислотный обмен с помощью ASCT1 in vitro и in vivo.

Чтобы исследовать способность ASCT1 высвобождать эндогенные аминокислоты, мы исследовали эффекты OH-Pro в острых срезах коры. Ожидается, что в качестве селективного субстрата ASCT1 OH-Pro будет обмениваться с внутриклеточными субстратами ASCT1. Перфузия OH-Pro вызвала высвобождение l-серина в срезах мышей WT, но не повлияла на высвобождение l-серина в срезах мышей ASCT1-KO (фиг. 6 A ). Эндогенные l-аланин и l-треонин также высвобождались OH-Pro в острых срезах (рис.6 B и C ). Хотя d-серин является подлинным субстратом ASCT1 для поглощения, добавление OH-Pro не вызывало высвобождения эндогенного d-серина, что указывает на то, что d-серин предпочтительно поглощается через ASCT1 (фиг. 6 D ). Точно так же OH-Pro не вызывал детектируемого высвобождения глицина (фиг. 6 E ).

ASCT1-опосредованный обмен аминокислот в срезах и микродиализ in vivo. ( A — E ) Выделение эндогенного l-серина ( A ), l-аланина ( B ), l-треонина ( C ), d-серина ( D ) и глицина. ( E ) получали перфузией срезов 1 мМ OH-pro в указанные моменты времени.Данные являются средними ± SEM семи экспериментов. Отличается от мышей ASCT1-KO при * P <0,05 и *** 0,001 (двухфакторный дисперсионный анализ с повторными измерениями и апостериорный тест Бонферрони). ( F — K ) Концентрации внеклеточных аминокислот в полосатом теле мышей в возрасте от 6 до 7 месяцев при микродиализе in vivo (12 мышей на группу). Данные представляют собой среднее значение ± SEM концентраций внеклеточных аминокислот, откалиброванных восстановлением in vivo. ** Отличается от WT при P <0.01, непарный двусторонний тест Стьюдента t . ( L ) Предлагаемая модель функции ASCT1 в сериновом челноке. Астроцитарный ASCT1 высвобождает l-серин, который впоследствии поглощается нейронами, чтобы подпитывать синтез d-серина SR. d-серин может высвобождаться нейронами через транспортер Asc-1 (Slc7a10) (26) и впоследствии поглощаться ASCT1 в астроцитах. l-аланин, l-треонин и d-серин могут служить внеклеточными субстратами, которые стимулируют экспорт l-серина через ASCT1 посредством гетерообмена.Нарушение транспорта l-серина у мышей ASCT1-KO может приводить к увеличению превращения l-серина в глицин ферментом серингидроксиметилтрансферазы (SHMT). Когда сериновый челнок нарушен, глицин, поглощаемый нейронами (пунктирная стрелка), может обеспечивать компенсаторный путь доставки l-серина в нейроны через нейрональный SHMT. Адаптировано с разрешения Servier Medical Art, https://smart.servier.com/.

Впоследствии мы контролировали внеклеточные концентрации типичных субстратов ASCT1 с помощью микродиализа полосатого тела in vivo.Значения корректировались восстановлением in vivo путем инфузии аминокислот, меченных стабильными изотопами (22). Мыши ASCT1-KO демонстрировали 25% снижение стационарных внеклеточных уровней d-серина без изменения внеклеточных уровней l-серина (фиг. 6 F и G ). Кроме того, у мышей ASCT1-KO наблюдалось снижение соотношения внеклеточного d-серина / общего серина (фиг. 6 H ). Мы не обнаружили изменений внеклеточных концентраций аланина, треонина и глицина у взрослых мышей ASCT1-KO (рис.6 I — K ).

Discussion

Мы идентифицировали ASCT1 как важный переносчик d- и l-серина в астроцитах и ​​потенциальный игрок в сериновом челноке между глией и нейронами (Fig. 6 L ). ASCT1 — обязательный обменник, который демонстрирует более быструю кинетику, чем однонаправленные переносчики аминокислот (12). Его обменная активность, вероятно, будет способствовать достижению стационарного градиента концентрации через мембрану за счет увеличения скорости транспорта его субстратов.Это согласуется с нашими наблюдениями на первичных культурах астроцитов, синаптосомах и острых срезах головного мозга. Однако наши данные микродиализа in vivo показывают, что ASCT1 не изменяет абсолютные концентрации внеклеточных аминокислот в стабильном состоянии, за исключением d-серина. Внеклеточные уровни d-серина были на 25% ниже в полосатом теле мышей ASCT1-KO (фиг. 6 G ). Снижение внеклеточного d-серина согласуется с более низкими уровнями общего d-серина в головном мозге у молодых и взрослых мышей ASCT1-KO (рис.2 и SI Приложение , рис. S3 A — C ).

Мы предполагаем, что ASCT1 осуществляет двунаправленный транспорт всех своих нейтральных аминокислотных субстратов, кроме d-серина (рис. 6 L ). Хотя ASCT1 катализирует высвобождение ранее загруженного d- [ ³ H] серина из клеток (11), активация гетерообмена ASCT1 с помощью OH-Pro в острых кортикальных срезах не высвобождает эндогенный d-серин. Этот результат согласуется с предыдущими исследованиями, демонстрирующими гораздо более низкие уровни эндогенного d-серина в астроцитах по сравнению с нейронами (5, 7⇓⇓ – 10).Вероятно, низкие количества d-серина в цитозоле астроцитов ниже сродства ASCT1.

Снижение как общего, так и внеклеточного уровней d-серина, наблюдаемое у мышей ASCT1-KO, предполагает частичное нарушение продукции d-серина в головном мозге. L-серин, производимый в астроцитах, по-видимому, перемещается к нейронам, чтобы подпитывать синтез d-серина в процессе, называемом сериновым челноком (рис. 6 L ) (10). Несмотря на то, что внеклеточный l-серин не изменился у взрослых мышей ASCT1-KO, наши наблюдения, что мыши ASCT1-KO испытывают дефицит в транспорте l-серина, подразумевают, что уравновешивающая природа транспортера ASCT1 необходима для обеспечения достаточного количества l-серина для d-серина. синтез в локальных контактах между астроцитами и нейронами (рис.6 L ). Дальнейшие доказательства, подтверждающие роль ASCT1 в сериновом челноке, получены из наших открытий, демонстрирующих значительное снижение как l-серина, так и d-серина в головном мозге мышей ASCT1-KO P4 (Fig. 2 E ). Однако микродиализ in vivo был непрактичным у детенышей мышей P4, где изменения в l-серине и других субстратах ASCT1 были более заметными, чем у взрослых мышей (сравните Рис. 2 E и SI Приложение , Рис. S3). Наши данные, однако, не исключают, что другие транспортеры l-серина могут частично компенсировать отсутствие ASCT1 у мышей KO.Другие компоненты серинового шаттла, такие как система нейронального захвата l-серина, еще предстоит идентифицировать.

В отличие от d-серина, уровни сфинголипидов, производных l-серина, были нормальными у мышей ASCT1-KO. Это может быть связано с высоким сродством серинпальмитоилтрансферазы (SPT), ключевого фермента биосинтеза сфинголипидов. SPT имеет в 30 раз более высокое сродство к l-серину ( K _m ∼ 0,3 мМ) (23) по сравнению с ферментом биосинтеза d-серина SR ( K _m ∼ 10 мМ) (10) .Следовательно, низкое сродство SR к l-серину делает синтез d-серина особенно чувствительным к нарушениям серинового челнока.

Наше исследование также раскрывает роль ASCT1 в метаболизме аланина, треонина и глицина, поскольку их общие уровни в мозге увеличиваются у мышей ASCT1-KO. Известно, что астроциты осуществляют метаболизм аланина в лактат (24), тогда как треонин является незаменимой аминокислотой, которая достигает головного мозга через гематоэнцефалический барьер. Вероятно, недостаточный транспорт аланина и треонина у мышей ASCT1-KO частично нарушит их метаболизм в астроцитах и ​​приведет к их накоплению.Однако глицин является плохим субстратом ASCT1 (рис. 1 H ). Более высокие уровни глицина у мышей ASCT1-KO могут быть следствием нарушения транспорта l-серина. Недостаточный обмен l-серина в астроцитах ASCT1-KO может способствовать превращению l-серина в глицин с помощью фермента серингидроксиметилтрансферазы (рис. 6 L ).

Интересно, что наши результаты с использованием как ферментативного удаления эндогенного глицина, так и ингибитора транспорта глицина предполагают более высокую занятость NMDAR глицином у мышей ASCT1-KO.Поскольку глицин также является регулятором синаптических NMDAR (4, 11, 21), более высокая занятость глицина может помочь сохранить NMDAR, как мы обнаружили у мышей ASCT1-KO. Более того, более высокий уровень глицина в головном мозге может обеспечивать компенсаторный механизм для преодоления нарушений в сериновом шаттле, поскольку глицин, высвобождаемый из астроцитов, может поглощаться нейронами и впоследствии превращаться в l-серин (рис. 6 L , пунктирная линия). Будущие исследования потребуются для уточнения точной роли ASCT1 в метаболизме аланина, треонина и глицина.Наше исследование также не предоставляет информации о роли ASCT1 в транспорте цистеина. Хотя l-цистеин является субстратом для ASCT1 in vitro, почти весь внеклеточный цистеин присутствует в форме цистина, который импортируется в клетки специальным переносчиком цистина / глутамата (25).

Наше открытие нижних объемов полосатого тела и гиппокампа у мышей ASCT1-KO, связанных с изменениями в экспрессии генов, связанных с развитием нервной системы, частично повторяет некоторые из изменений нервного развития у пациентов с мутациями в транспортере ASCT1 (18, 19).Мы обнаружили, что мыши ASCT1-KO также демонстрируют двигательные нарушения и поведенческие дефициты при обучении и аффективных тестах. Мыши ASCT1-KO продемонстрировали нарушение пространственного обучения в водном лабиринте Морриса, что нельзя объяснить исключительно их более низкой скоростью плавания. Хотя мыши ASCT1-KO демонстрировали меньшие объемы гиппокампа, обширная электрофизиология ex vivo и in vivo не выявила дисфункции гиппокампа в наших условиях записи. Вполне вероятно, что комбинированные нарушения двигательной функции (напр.g., более низкая скорость плавания, активность открытого поля и латентность в стержне ротора) наряду с изменениями в аффективном поведении (более низкое предпочтение сахарозы и возможное беспокойство, что выявляется более высокой реакцией испуга), возможно, способствовали нарушению обучаемости в воде Морриса. лабиринт.

Фенотипические отклонения у мышей ASCT1-KO отличаются от фенотипических отклонений у мышей SR-KO, у которых в основном отсутствует d-серин (3). Мыши SR-KO имеют нормальную двигательную функцию, неизменную реакцию вздрагивания и отсутствие признаков нарушения обучения в водном лабиринте Морриса.Следовательно, двигательные нарушения и нарушения обучения, наблюдаемые у мышей ASCT1-KO, вероятно, являются результатом комбинации дефицита d-серина с более широким метаболическим изменением аминокислот, которые мы описали здесь, включая аланин, треонин и глицин. В этой связи мыши ASCT1-KO будут полезны для разработки терапевтических вмешательств для предотвращения или уменьшения нарушений развития нервной системы у пациентов с мутациями в ASCT1.

Материалы и методы

Животные.

Slc1a4 ^{tm1e (KOMP) Мыши Wtsi} (ASCT1-KO) были получены из Института Сэнгера на генетическом фоне C57BL / 6N.Мыши Slc1a5 KO (ASCT2-KO) были получены от Taconic и скрещены на нашем предприятии с мышами C57BL / 6J в течение 10 поколений. Все процедуры на животных соответствовали требованиям Комитета по надзору за экспериментами на животных (Технион — Израильский технологический институт).

Вестерн-блоты.

Мозг гомогенизировали в буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl (pH 7,4), 100 мМ NaCl, 0,4 мМ PMSF и 1 мМ EDTA. Гомогенат центрифугировали при 1500 × g в течение 10 минут, супернатант собирали и затем центрифугировали при 200000 × g в течение 30 минут.Осадок, содержащий мембранную фракцию, подвергали SDS / PAGE с последующим вестерн-блоттингом. Для вестерн-блоттинга ASCT2 образцы сначала дегликозилировали путем добавления 1000 единиц PNGase F в неденатурирующих условиях в соответствии с инструкциями производителя (New England Biolabs). Чтобы свести к минимуму агрегацию мембранных белков, образцы не кипятили после добавления буфера для образцов, содержащего SDS.

Поглощение аминокислот в клеточных культурах.

Первичные культуры астроцитов получали из коры мышей P0 – P2, как описано ранее (11), и использовали через 12–14 дней после посева.Для экспериментов по поглощению культуры инкубировали в 96-луночных планшетах в течение 5-7 минут с 1 мкМ [ ³ H] аминокислот в физиологическом растворе, забуференном Hepes (HBS, в миллимолях: 137 NaCl, 5,4 KCl, 0,18 Na ₂ ). HPO ₄ , 0,44 KH ₂ PO ₄ , 0,41 MgSO ₄ , 0,49 MgCl ₂ , 1,07 CaCl ₂ , 5,6 d-глюкоза, 4,2 NaHCO ₃ , 1 пируват Na и 10 Hepes, pH 7,4) при 25 ° C. Транспорт [ ³ H] аминокислот прекращали четырехкратной промывкой клеток ледяной HBS и обработкой, как описано ранее (11).

Дополнительные методы описаны в Приложении SI , Дополнительные методы .

Благодарности

Мы благодарим О. Шварца и доктора Э. Сасс-Тоби (Центр биовизуализации BCF, медицинский факультет Техниона) за МРТ; Доктору Итамару Хану за руководство и контроль при проведении МРТ-анализа; и доктора. Лиат Линде, доктор Ронит Модаи-Ход, Элизабета Гинзбург и Дорон Фогель (Центр геномики BCF, медицинский факультет, Технион) для секвенирования РНК. Работа финансировалась Израильским научным фондом (H.W.) и фонд Вивиан и Оскара Ласко для исследований болезни Паркинсона и Альцгеймера (HW), Центр нейродегенеративных заболеваний головного мозга им. Аллена и Джуэлла Принса (HW, DD и AA), а также фонды партнерства Мичиган-Израиль в области исследований и образования. (HW и RTK). Ж.-М. Б. была поддержана Национальным институтом Санте и де ла Recherche Scientifique. Исследование T.Y. было поддержано Японским агентством медицинских исследований и разработок (AMED) в рамках гранта JP18dm0107083, AMED-Core Research for Evolutional Science and Technology в рамках гранта JP18gm0

4 и Министерством образования, культуры, спорта, науки и технологий в рамках гранта JP18H05435.

Сноски

• Вклад авторов: H.W. задумал проект; D.D., J.-M.B., A.A. и H.W. спланированное исследование; E.K., S.Z., I.R., A.C.V., O.R., H.S., C.S., K.K., K.E., M.W., J.-M.B., A.A. и H.W. проведенное исследование; O.B., K.E., T.Y. и R.T.K. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; E.K., S.Z., I.R., A.C.V., O.R., H.S., C.S., D.D., T.Y., M.W., R.T.K., J.-M.B., A.A. и H.W. проанализированные данные; и Х. написал газету.

• Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

• Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.

• Размещение данных: данные, представленные в этой статье, были депонированы в базе данных Gene Expression Omnibus (GEO), https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo (номер доступа GSE108675).

• Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1722677115/-/DCSupplemental.

Транспортер бикарбоната необходим для летальности Bacillus anthracis

Abstract

В патогенной бактерии Bacillus anthracis вирулентность требует индуцированной экспрессии токсина сибирской язвы и генов капсул.Повышенные уровни CO ₂ / бикарбоната, индикатор среды хозяина, обеспечивают сигнал ex vivo для увеличения экспрессии факторов вирулентности, но механизм, лежащий в основе индукции, и его значение in vivo неизвестны. Мы идентифицировали ранее не охарактеризованный переносчик ABC (BAS2714-12), аналогичный переносчикам бикарбоната в фотосинтетических цианобактериях, который необходим для индукции бикарбонатом экспрессии гена вирулентности. Делеция генов переносчика устраняет индукцию экспрессии генов токсина и сильно снижает скорость поглощения бикарбоната ex vivo, демонстрируя, что локус BAS2714-12 кодирует переносчик бикарбоната ABC.Штамм с делецией переносчика бикарбоната был авирулентным в модели инфекции на мышах A / J. Ингибиторы карбоангидразы, которые предотвращают взаимное превращение CO ₂ и бикарбоната, значительно влияют на экспрессию токсина только в отсутствие бикарбоната или переносчика бикарбоната, что позволяет предположить, что активность карбоангидразы не важна для индукции фактора вирулентности и этого бикарбоната, а не CO ₂ , это сигнал, необходимый для индукции вирулентности. Идентификация этого нового переносчика бикарбоната, необходимого для вирулентности B.anthracis может иметь отношение к другим патогенам, таким как Streptococcus pyogenes , Escherichia coli , Borrelia burgdorferi и Vibrio cholera , которые регулируют экспрессию фактора вирулентности в ответ на CO1118 / burgdorferi _{2 может быть целью антибактериального вмешательства.}

Сведения об авторе

Бактериальные инфекции, приобретенные в больницах, вызывают все большую озабоченность в области общественного здравоохранения. Бактерии, вызывающие эти инфекции, часто устойчивы к нескольким антибиотикам, что делает проблему внутрибольничных инфекций еще более серьезной и необходимость нового антибактериального лечения более острой.Бактерии используют множество механизмов, чтобы вызвать инфекцию, но первым шагом должно быть распознавание среды хозяина. В этой работе мы определили первый компонент пути, который позволяет бактериальному патогену, Bacillus anthracis , распознавать среду, в которой развивается инфекция, то есть кровь хозяина. Обнаруженная молекула — это бикарбонат, критически важный компонент крови для поддержания правильного pH. Бикарбонат необходим для индукции факторов вирулентности B.anthracis и, скорее всего, имеет отношение к инфекциям другими организмами, такими как Streptococci , E. coli , Borrelia , Clostridium botulinum и Vibrio cholera . Наша идентификация переносчика B. anthracis , ответственного за интернализацию бикарбоната и активацию производства фактора вирулентности, представляет собой новую мишень для нового антибактериального вмешательства, которое может быть эффективным в отношении различных бактериальных патогенов.

Образец цитирования: Wilson AC, Soyer M, Hoch JA, Perego M (2008) Транспортер бикарбоната необходим для Bacillus anthracis Летальность. PLoS Pathog 4 (11): e1000210. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000210

Редактор: Майкл С. Гилмор, Исследовательский институт глаза Шепенса, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 27 августа 2008 г .; Одобрена: 20 октября 2008 г .; Опубликовано: 21 ноября 2008 г.

Авторские права: © 2008 Wilson et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Это исследование было частично поддержано грантом AI055860 Национального института аллергии и инфекционных заболеваний и грантами GM019416 и GM055594 Национального института общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения.Синтез олигонуклеотидов и секвенирование ДНК были частично поддержаны Stein Beneficial Trust.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Bacillus anthracis — это грамположительная эндоспорообразующая бактерия, являющаяся этиологическим возбудителем сибирской язвы. Сибирская язва — это, в первую очередь, болезнь травоядных животных, зараженных пастбищами, с инфицированием человека в результате прямого контакта с инфицированными продуктами животного происхождения или преднамеренного распространения спор сибирской язвы в качестве биологического оружия.Сибирская язва может проявляться как локализованные кожные инфекции или как системные инфекции, возникающие в результате вдыхания спор, проглатывания или распространения кожных инфекций. Хотя локализованные кожные инфекции излечимы, системные инфекции почти всегда приводят к летальному исходу, причем смерть наступает в течение нескольких дней после первоначального заражения [1].

Вирулентность в организме-хозяине-млекопитающем требует экспрессии как токсина сибирской язвы, так и антифагоцитарной капсулы. Трехкомпонентный токсин сибирской язвы кодируется тремя несмежными генами, lef , cya и pagA , переносимых плазмидой вирулентности pXO1 [2]. lef кодирует летальный фактор (LF), цинковую металлопротеазу, нацеленную на передачу сигналов MAP-киназы хозяина [3], cya кодирует фактор отека (EF), аденилатциклазу, которая увеличивает клеточные уровни цАМФ [4], а pagA кодирует Защитный антиген (PA), который образует поры, позволяющие проникать компонентам токсина [5]. Антифагоцитарная капсула поли-D-глутаминовой кислоты, которая необходима для распространения бактерий в организме хозяина [6], кодируется генами в опероне cap , переносимом плазмидой вирулентности pXO2 [7], [8].Регуляторный белок AtxA, кодируемый геном atxA на pXO1, необходим для транскрипции как генов токсина, так и капсульного оперона [9], [10]. Контроль AtxA, в свою очередь, интегрирован в несколько метаболических регуляторных цепей, включая фосфорилирование споруляции через AbrB [11] и фосфоенолпируват-зависимую фосфотрансферазную систему через регулируемое фосфорилирование / дефосфорилирование остатков гистидина [12].

Многие сигналы окружающей среды влияют на экспрессию B.anthracis факторов вирулентности, одним из первых идентифицированных является влияние уровней CO ₂ / бикарбоната на образование капсул и вирулентность [13]. Считается, что повышенные уровни CO ₂ / бикарбоната служат сигналом среды хозяина млекопитающего и сигналом для индукции экспрессии факторов вирулентности. Инкубация B. anthracis в среде с добавлением бикарбоната натрия, выращенной при повышенных уровнях CO ₂ (более 5%), приводит примерно к 10-кратному увеличению транскрипции всех трех генов токсинов [14] и более чем в 20 раз. -кратное увеличение транскрипции капсульного оперона [15].AtxA необходим для индукции CO ₂ / бикарбоната токсиновых и капсульных генов, однако на экспрессию AtxA не влияет повышенный уровень CO ₂ / бикарбоната [16], [17]. Присутствие дополнительных регуляторных компонентов CO ₂ / бикарбонат на основной хромосоме предполагает наблюдение, что транскрипция pagA индуцируется CO ₂ / бикарбонатом в штамме pXO1 ^— pXO2 ^— при atxA и только pagA поставляются на мультикопийных плазмидах [18].Кроме того, не охарактеризованный ген, переносимый pXO1, также может играть роль в регуляции экспрессии токсина CO ₂ / бикарбонат [19]. Несмотря на эти косвенные предположения о более широком регулировании, дополнительные регуляторные компоненты CO ₂ / бикарбонат еще не определены напрямую.

Без механистической основы для регуляции экспрессии фактора вирулентности CO ₂ / бикарбонат, наше внимание было обращено на выявление консервативных ответов на гомеостаз CO ₂ / бикарбонат и соотнесение этих путей с B.Антиквариат . Изучение метаболизма CO ₂ / бикарбоната осложняется его лабильным характером: CO ₂ , H ₂ CO ₃ , HCO ₃ ^— и CO ₃ ^2-, существующих в равновесие в зависимости от pH, температуры и парциального давления CO ₂ . В типичных биологических условиях CO ₂ обычно диффундирует через мембраны; попав внутрь клетки, углеангидразы могут активно преобразовывать CO ₂ и бикарбонат.С другой стороны, бикарбонат непроницаем для липидных бислоев, и многие клеточные системы полагаются на специальные транспортеры для импорта бикарбоната [20]. Одним из наиболее изученных бактериальных транспортеров бикарбоната является транспортная система CmpABCD ABC у цианобактерий вида Synechococcus PCC 7942 (Рисунок 1) [21]. У этой бактерии повышенная концентрация CO ₂ вокруг рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы / оксигеназы (Rubisco) важна для эффективной фиксации углерода. Synechococcus использует этот высокоаффинный переносчик бикарбоната для импорта и накопления неорганического углерода (такого как HCO ₃ ^—), который затем может быть преобразован карбоангидразой в CO ₂ в присутствии Rubisco в специализированном отделении, называемом карбоксисома [22].

Рис. 1. Схематическое изображение переносчиков бикарбоната типа ABC в Synechococcus .

Субстрат-связывающий белок CmpA предположительно закреплен на периплазматической стороне цитоплазматической мембраны через липидный якорь, прикрепленный к консервативному цистину на конце сигнального пептида липопротеина [45].Домен SBP состоит из двух доменов, организованных в форме C-зажима [23]. В Synechococcus домен SBP также присутствует внутриклеточно на карбокси-конце субъединицы CmpC АТФазы. Белок CmpC отсутствует у B. anthracis и S. pyogenes . Кроме того, в S. pyogenes домен SBP слит на своем С-конце с CmpB-подобным доменом пермеазы.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000210.g001

Здесь мы сообщаем об идентификации переносчика ABC, сходного с системой Synechococcus CmpABCD, которая необходима для вирулентности в B.Антиквариат . Делеция генов переносчика снижает захват бикарбоната и устраняет индукцию гена токсина ex vivo в ответ на бикарбонат. Что еще более важно, штамм, лишенный переносчика, был авирулентным в модели инфекции сибирской язвы на мышах, демонстрируя важность этого пути для распознавания среды хозяина и патогенеза.

Результаты

Идентификация предполагаемого транспортера бикарбоната ABC

Несмотря на признанную роль CO ₂ / бикарбоната в синтезе токсина, механизм, связывающий уровни CO ₂ / бикарбоната с регуляцией токсина и вирулентностью B.anthracis еще предстоит охарактеризовать. В качестве обратного генетического подхода для идентификации компонентов пути регуляции CO ₂ / бикарбонат мы провели поиск в геноме штамма B. anthracis Sterne (GenBank: AE017225) на предмет белковых последовательностей, аналогичных продуктам оперона cmpABCD , кодирующего переносчик бикарбоната Synechococcus elongatus PCC 6301 (GenBank: AP008231). В отличие от многих переносчиков ABC, которые в значительной степени характеризуются на основе мультисубъединичной организации, включая белки с АТФ-связывающими доменами ABC-типа в ассоциации с гидрофобными доменами пермеазы, идентификации CmpABCD-подобных транспортеров бикарбоната ABC помогают структурные особенности домена связывания субстрата для бикарбоната. и очень похожие переносчики нитратов [23], [24].

Поиск BLASTP выявил сходство между компонентами системы CmpABCD и продуктами генов BAS2714-12 и BAS4675-77 (Таблица 1). Оба оперона еще не были охарактеризованы, но, по-видимому, кодируют компоненты транспортеров ABC. BAS2714 и BAS4676 кодируют АТФ-связывающие белки, BAS2713 и BAS4675, как предполагается, кодируют субстрат-связывающие белки, а BAS2712 и BAS4677, вероятно, являются белками трансмембранной пермеазы. В отличие от cmpABCD , который кодирует два АТФ-связывающих белка (CmpC, также содержащий CmpA-подобный субстрат-связывающий белок, и CmpD) (рисунок 1), два B.Локусы anthracis кодируют только один однодоменный АТФ-связывающий белок (BAS2714 или BAS4676). Роль в транспорте бикарбоната предполагалась присутствием в белках BAS2713 и BAS4675 домена TauA (номер доступа NCBI COG0715), консервативного элемента, связанного с периплазматическими компонентами связывания субстрата ABC-транспортеров, специфичных для нитрата, сульфоната или бикарбоната. Кроме того, биоинформатический анализ с распознаванием складок, проведенный сервером FFAS03, показал очень значимый результат (-60.От 5 до -64,8) между BAS2713 или BAS4675 и белком, связывающим бикарбонатный (CmpA) и нитратный (NrtA) субстрат, что свидетельствует о структурной и функциональной гомологии, несмотря на ограниченную консервацию последовательности. На основании сходства с белками CmpABCD и консервативных свойств, общих для переносчиков бикарбоната, системы BAS2714-12 и BAS4675-77 оказались хорошими кандидатами на роль переносчика бикарбоната ABC B. anthracis .

Удаление BAS2714-12 устраняет индуцированную бикарбонатом экспрессию генов токсина

Для исследования роли BAS2714-12 и BAS4675-77 в метаболизме и вирулентности бикарбонатов, B.Были созданы производные штаммы anthracis 34F2 (pXO1 ⁺ pXO2 ^—), содержащие безмаркерные делеции трех генов, аннотированных как BAS2714-12 или BAS4675-77. Как описано в экспериментальных процедурах, с использованием плазмиды pAW091 была удалена область от 97 нуклеотидов перед сайтом начала трансляции BAS2714 до 33 нуклеотидов перед кодоном терминации BAS2712. Это полностью удалило кодирующие области BAS2714 и BAS2713, оставив при этом небольшую часть 3′-конца кодирующей последовательности BAS2712 и всю межгенную область между BAS2712 и BAS2711 нетронутыми, чтобы оставить потенциальные регуляторные последовательности, контролирующие экспрессию нижележащего гена, BAS2711. .

Аналогичным образом, для делеции BAS4675-77 интеграция плазмиды pAW093 привела к делеции области от 70 нуклеотидов ниже сайта начала трансляции BAS4675 до 52 нуклеотидов выше терминального кодона BAS4677. Это полностью исключило кодирующие области BAS4676, оставив при этом небольшую часть 5′-конца кодирующей последовательности BAS4675 и небольшую часть 3′-конца кодирующей последовательности BAS4677 нетронутыми, чтобы оставить потенциальные регуляторные последовательности, контролирующие экспрессию генов выше по течению. и ниже оперона.

Во всех испытанных условиях делеция BAS2714-12 или BAS4675-77 не оказывала значительного влияния на рост по сравнению с родительским штаммом 34F2 (фиг. 2 и данные не показаны).

Рисунок 2. Рост клеток и экспрессия гена вирулентности в B. anthracis 34F2 и 34F2ΔBAS2714-12 в различных условиях роста.

Для анализов β-галактозида клетки, несущие слияние pagA-lacZ или atxA-lacZ на репликативном векторе pTCV- lac , выращивали в среде с добавлением канамицина.Анализы β-галактозидазы проводили на образцах, взятых с часовыми интервалами, как указано. (A) репортерных штаммов pagA-lacZ , выращенных в бульоне LB на воздухе при 37 ° C. (B) репортерных штаммов pagA-lacZ , выращенных в среде R с 0,8% NaHCO ₃ при 5% CO ₂ при 37 ° C. (C) репортерных штаммов atxA-lacZ , выращенных в среде R с 0,8% NaHCO ₃ при 5% CO ₂ при 37 ° C. Символы на всех панелях: — □ — рост клеток 34F2; — ○ — рост клеток 34F2ΔBAS2714-12; -▪- экспрессия LacZ 34F2; — • — Выражение LacZ 34F2ΔBAS2714-12.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000210.g002

Экспрессия pagA , кодирующая субъединицу PA токсина сибирской язвы, отслеживалась в различных условиях роста, имитируя среду хозяина и среду, не являющуюся хозяином, известную для влияют на экспрессию гена вирулентности. Репортер pagA-lacZ в репликативном векторе pTCV- lac [25] трансформировали в родительские штаммы ΔBAS2714-12 и ΔBAS4675-77 и использовали для мониторинга уровней экспрессии pagA посредством активности β-галактозидазы.Чтобы воспроизвести условия, не связанные с хозяином, которые приводят к низкому уровню экспрессии генов токсина, штаммы выращивали в бульоне LB на воздухе в стандартных лабораторных условиях (рис. 2A), в то время как рост в определенной среде R в присутствии 0,8% NaHCO ₃ в 5% атмосфере использовался для имитации среды хозяина (рис. 2В). Делеция генов BAS4675-77 не повлияла на экспрессию pagA ни в одном из тестируемых условий роста, что указывает на то, что эта транспортная система не играет роли в транспорте бикарбоната и / или регуляции экспрессии генов токсина и, следовательно, в дальнейшем не анализировалась (данные не показаны. ).

Делеция генов BAS2714-12 не повлияла на экспрессию pagA , когда клетки выращивали в LB на воздухе, что позволяет предположить, что эта система не вносит вклад в экспрессию токсина в условиях роста без хозяина (рис. 2А). Напротив, когда штаммы выращивали в определенной R-среде в условиях, которые, как известно, индуцируют экспрессию токсина (0,8% NaHCO ₃ и 5% CO ₂ ), индукция pagA в штамме с делецией BAS2714-12 была отменена. по сравнению с родительским штаммом (рис. 2В).Эти наблюдения предполагают, что BAS2714-12 необходим для индукции экспрессии токсина в условиях роста CO ₂ / бикарбонат, которые, как считается, имитируют хозяина-млекопитающего.

Первичный регуляторный белок экспрессии токсинового гена в B. anthracis , AtxA, необходим для наблюдаемой индукции экспрессии токсина в ответ на CO ₂ / бикарбонат [18], [19]. Предыдущие исследования показали, что транскрипция atxA не индуцируется напрямую в ответ на повышенный уровень CO ₂ / бикарбонат [16].Чтобы исследовать вклад BAS2714-12 в регуляцию транскрипции atxA , репортер atxA-lacZ , переносимый вектором pTCV- lac , был электропорирован в штаммах 34F2 и 34F2ΔBAS2714-12. В условиях роста, которые индуцировали экспрессию токсина и при которых мы наблюдали существенное различие в экспрессии pagA , экспрессия atxA не изменилась в 34F2ΔBAS2714-12 по сравнению с исходным штаммом (рис. 2С). Таким образом, в соответствии с отсутствием эффекта на atxA за счет роста в присутствии CO ₂ / бикарбоната [16], нарушение метаболизма бикарбоната за счет делеции предполагаемого переносчика бикарбоната BAS2714-12 не влияло на транскрипцию atxA . .

Чтобы гарантировать, что делеция BAS2714-12 ответственна за наблюдаемые фенотипы, штамм с делецией BAS2714-12 был дополнен этими генами, несущими репликативную плазмиду. Локус BAS2714-12, а также область 640 пар оснований выше BAS2714, которая может нести потенциальные промоторные и регуляторные последовательности, клонировали в мультикопийном векторе pHT315 для генерации плазмиды pAW144, и обе плазмиды электропорировали в штамм 34F2ΔBAS2714-12. Экспрессию защитного антигена контролировали вестерн-блоттингом супернатантов культур (фиг. 3).При выращивании в условиях, индуцирующих токсин, образцы супернатанта 34F2 содержали детектируемые количества PA, в то время как образцы супернатанта 34F2ΔBAS2714-12 не содержали детектируемых уровней PA. При переносе пустой плазмиды pHT315 PA оставался не обнаруживаемым в образцах супернатанта мутантного штамма BAS2714-12, в то время как присутствие pAW144 восстанавливало экспрессию PA, демонстрируя, что делеция BAS2714-12 фактически ответственна за устранение индукции токсина.

Рисунок 3. Вестерн-блоттинг с использованием антитела α-PA.

Штаммы, выращенные в среде R с 0,8% NaHCO ₃ при 5% CO ₂ при 37 ° C с добавлением эритромицина и линкомицина по мере необходимости. Количество образца, загруженного на 10% гель SDS-PAGE, нормализовали относительно плотности клеток. Дорожка 1, MagicMark XP; Дорожка 2, штамм 34F2; Дорожка 3, штамм 34F2ΔBAS2714-12; Дорожка 4: штамм 34F2ΔBAS2714-12, несущий плазмиду pHT315; Дорожка 5: штамм 34F2ΔBAS2714-12, несущий плазмиду pAW144.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000210.g003

Удаление BAS2714-12 снижает поглощение бикарбонатов

Сходство последовательностей с известными переносчиками бикарбоната и устранение индуцированной бикарбонатом экспрессии токсина после делеции предполагают, что BAS2714-12 может функционировать как переносчик бикарбоната. Чтобы напрямую проверить функцию BAS2714-12 в транспорте бикарбоната, мы сравнили поглощение радиоактивно меченного NaH ¹⁴ CO ₃ в родительском и мутантном штаммах. Штаммы 34F2 и 34F2ΔBAS2714-12 выращивали в R-среде без добавления NaHCO ₃ в присутствии 5% CO ₂ до OD ₆₀₀ , равного 0.4. К каждой культуре добавляли NaH ¹⁴ CO ₃ и измеряли поглощение NaH ¹⁴ CO ₃ в нескольких временных точках с помощью жидкостного сцинтилляционного счета (Фиг.4). Поглощение ¹⁴ C в штамме 34F2ΔBAS2714-12 происходило со значительно более низкой скоростью (в 6 раз), чем в родительском штамме 34F2, что свидетельствует о нарушении поглощения бикарбоната и дает дополнительные доказательства того, что BAS2714-12 функционирует как переносчик бикарбоната.

Рис. 4. Поглощение H ¹⁴ CO ₃ ^— на B.anthracis 34F2 и 34F2ΔBAS2714-12.

Клетки выращивали в среде R без добавления NaHCO ₃ при 5% CO ₂ при 37 ° C до OD ₆₀₀ = 0,4. NaH ¹⁴ CO ₃ добавляли в момент времени 0 и образцы клеток собирали в указанные моменты времени. H ¹⁴ CO ₃ ^{— поглощение} определяли по накоплению ¹⁴ C в клетках, как измерено с помощью жидкостного сцинтилляционного счета; -▪- родительский штамм 34F2, — • — штамм 34F2ΔBAS2714-12.Данные были получены из 3 независимых культур, и планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение от среднего.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000210.g004

Ингибиторы карбоангидразы незначительно влияют на индукцию экспрессии токсина бикарбонатом

Транспортеры бикарбоната импортируют непроницаемый для мембраны бикарбонат, в то время как ферменты карбоангидразы взаимно превращают бикарбонат и CO ₂ и, таким образом, способны превращать проницаемый через мембрану CO ₂ в бикарбонат [20].На индукцию экспрессии токсина в B. anthracis влияют как бикарбонат, так и CO ₂ , и, учитывая взаимное превращение этих двух соединений, разделение относительного влияния каждого соединения на вирулентность было затруднено. Идентификация и удаление транспортера бикарбоната, необходимого для индукции токсина, теперь предоставили инструмент для дальнейшего исследования механизма индукции.

Был протестирован набор доступных ингибиторов карбоангидразы, включая ацетазоламид, этоксизоламид, гидрохлоротиазид и топирамат.Гидрохлоротиазид оказался наиболее эффективным, что было измерено по снижению уровней экспрессии токсина (данные не показаны). В присутствии NaHCO ₃ и CO ₂ экспрессия pagA-lacZ в родительском штамме 34F2 была идентична с гидрохлоротиазидом или без него (фиг. 5A). Однако остаточная экспрессия pagA-lacZ в штамме 34F2▵BAS2714-12 полностью подавлялась гидрохлоротиазидом. Без добавления NaHCO ₃ , но в присутствии 5% CO ₂ в атмосфере гидрохлоротиазид снижал экспрессию pagA-lacZ в родительском штамме 34F2, а гидрохлоротиазид дополнительно снижал уровень экспрессии pagA-lacZ в штамме 3414F2ΔBAS27 -12 (рис. 5В).Эти данные предполагают, что остаточная экспрессия pagA-lacZ в отсутствие добавленного NaHCO ₃ обусловлена ​​превращением CO ₂ в ^— HCO ₃ под действием карбоангидразы. Эти данные также подтверждают идею о том, что именно бикарбонат, а не CO ₂ непосредственно сигнализирует об индукции экспрессии фактора вирулентности в условиях роста хозяина.

Рисунок 5. Экспрессия гена токсина в B. anthracis 34F2 и 34F2ΔBAS2714-12 в присутствии гидрохлоротиазида, ингибитора карбоангидразы.

Клетки, несущие слияние pagA-lacZ на репликативном векторе pTCV- lac или без промотора pTCV- lac , выращивали в среде с добавлением канамицина. Анализы β-галактозидазы проводили на образцах, взятых с часовыми интервалами, как указано. (A) Штаммы, выращенные в среде R с 0,8% NaHCO ₃ под 5% CO ₂ при 37 ° C. (B) Штаммы, выращенные в среде R без добавления NaHCO ₃ при 5% CO ₂ при 37 ° C. Символы на всех панелях: -▪- 34F2 pagA-lacZ выражение; — □ — экспрессия 34F2 pagA-lacZ с 900 мкМ гидрохлоротиазидом; — • — экспрессия 34F2ΔBAS2714-12 pagA-lacZ ; — ○ — экспрессия 34F2ΔBAS2714-12 pagA-lacZ с 900 мкМ гидрохлоротиазидом; -▴- экспрессия pTCV- lac без промотора 34F2; -▵- Без промотора 34F2 экспрессия pTCV- lac с 900 мкМ гидрохлоротиазидом.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000210.g005

Удаление BAS2714-12 сделало

Хотя роль CO ₂ / бикарбоната в индукции экспрессии гена вирулентности хорошо продемонстрирована в лабораторных пакетных культурах ( ex vivo ), пока не предоставлено никаких доказательств того, что эта роль также актуальна для B. anthracis клетки, растущие в инфицированном хозяине ( in vivo, ).Чтобы исследовать, влияет ли неспособность импортировать бикарбонат на вирулентность B. anthracis , была использована модель инфекции на животных, в которой использовалась линия мышей, очень чувствительная к неинкапсулированным штаммам Sterne [26]. Шестинедельным самкам мышей штамма A / J с дефицитом комплемента (The Jackson Laboratory) подкожно вводили 10 ⁶ спор родительского штамма 34F2 или мутантного штамма 34F2▵BAS2714-12 и наблюдали в течение 12 дней.Группа из пяти мышей A / J была инфицирована каждым штаммом. В течение 54 часов у мыши из контрольной группы 34F2, инфицированной родительским штаммом, наблюдалась значительная опухоль и снижалась физическая активность. Смерть наступила в течение следующих 10 часов. В этой группе у двух других мышей появились симптомы заболевания и они умерли в течение 72 часов, четвертая — через 84 часа, а пятая мышь — через 96 часов после заражения (Фиг.6). Напротив, все 5 мышей в группе, инфицированной мутантом, выжили до 12 дней без явных признаков опухоли или заболевания.В то время как родительский штамм является полностью вирулентным в этой модели мыши, ΔBAS2714-12 является авирулентным, что впервые демонстрирует, что транспорт бикарбоната важен для патогенеза B. anthracis in vivo .

Фигура 6. 34F2 и 34F2ΔBAS2714-12 в мышиной модели инфекции.

В общей сложности 10 самкам мышей A / J в возрасте 6 недель, 5 для 34F2 (- • -) и 5 ​​для 34F2ΔBAS2714-12 (-▪-), подкожно инъецировали 10 ⁶ спор и контролировали курс 12 дней.Ежедневно за мышами наблюдали визуально на предмет активности, и данные выражали в виде процента выживаемости.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000210.g006

Обсуждение

B. anthracis должен интегрировать многочисленные сигналы окружающей среды, чтобы эффективно воспроизводить и вызывать заболевание. B. anthracis основан на многофазном образе жизни: неметаболически активные споры необходимы для заражения и распространения между хозяевами, но сами по себе неспособны к репликации, в то время как метаболически активные вегетативные клетки реплицируются и вызывают заболевание в хозяине, но неспособны распространяться между хозяевами. .В течение инфекционного цикла пути, ведущие либо к развитию через споруляцию, либо к патогенезу через образование токсинов и капсул, являются взаимоисключающими, предполагая существование регуляторного баланса между двумя путями [27]. То, что бактерия распознает в хозяине как сигналы, вызывающие механизмы патогенеза, и природа механизмов, необходимых для принятия участия в развитии или патогенезе, остаются плохо изученными. Здесь мы определили важный компонент для индукции экспрессии гена вирулентности в ответ на уровни бикарбоната в организме хозяина и использовали это открытие для понимания внеклеточных и внутриклеточных сигналов, контролирующих вирулентность.

Наши данные продемонстрировали, что гены BAS2714-12 кодируют ранее не охарактеризованный переносчик бикарбоната ABC. Подобные переносчики ABC были идентифицированы и охарактеризованы у фотосинтезирующих бактерий [21], но это первое сообщение о переносчике ABC, участвующем в вирулентности у патогенных видов бактерий. Система BAS2714-12 изначально была аннотирована (Gen Bank: AE017225) как предполагаемый переносчик сульфонатов, во многом из-за сходства с охарактеризованным переносчиком Ssu ABC в B.subtilis . Однако, учитывая консервативность между переносчиками бикарбоната, нитрата и сульфоната ABC, отсутствие охарактеризованных переносчиков бикарбоната у грамположительных бактерий и сложность прогнозирования функции переносчиков ABC на основе нуклеотидной последовательности, определение специфичности субстрата неоднозначно. Здесь мы показали, что транспортер ABC, кодируемый BAS2714-12, необходим для интернализации ¹⁴ C-меченного бикарбоната. Вместе с тем, что добавление таурина, субстрата B.subtilis Ssu system [28] и широко доступное сульфонатное соединение в организме хозяина, не влияет на экспрессию токсинового гена и не конкурирует с индукцией бикарбоната (неопубликованные данные), свидетельствует о том, что система BAS2714-12 специфична для транспорта бикарбоната. Дополнительное наблюдение, что делеция генов BAS2714-12 устраняет бикарбонат-зависимую индукцию экспрессии генов токсина, подтверждает роль этой системы транспортеров в метаболизме бикарбонатов у B. anthracis .

Удаление BAS2714-12 устраняет индукцию бикарбонатом экспрессии pagA в условиях роста, которые имитируют среду животного-хозяина, но существенно не изменяют экспрессию в неиндуцирующих условиях. В среде LB без добавления бикарбоната или CO ₂ , условиях, которые имитируют условия, не связанные с хозяином и не индуцирующие токсины, экспрессия pagA не изменяется в штамме с делецией. Напротив, при выращивании в R-среде с добавлением бикарбоната и CO ₂ , условиях, которые имитируют условия индукции хозяина и токсина, экспрессия pagA остается очень низкой в ​​мутантном штамме, в то время как экспрессия pagA сильно индуцируется в родительском штамме. .Эти наблюдения предполагают, что на базальные уровни экспрессии pagA не влияет делеция BAS2714-12, но вместо этого для специфической индукции бикарбонатом требуется присутствие BAS2714-12. Несмотря на сильное влияние делеции BAS2714-12 на индукцию токсина, штамм с делецией не показывает различий в росте при любых испытанных условиях по сравнению с родительским штаммом, что позволяет предположить, что поглощение бикарбоната через BAS2714-12 не вносит значительного вклада в невирулентные метаболические пути при лабораторные условия выращивания.Делеция BAS2714-12 может быть дополнена поставкой локуса в транс- репликативной плазмиды. Небольшие различия в экспрессии pagA между родительскими штаммами и штаммами с делецией-комплементацией, вероятно, связаны с различиями в экспрессии или количестве копий гена BAS2714-12, переносимого на плазмиде с относительно высоким числом копий (15 копий на клетку [29]).

Присутствие регулятора AtxA необходимо для высокого уровня экспрессии pagA в ответ на CO ₂ / бикарбонат, но транскрипция atxA напрямую не регулируется CO ₂ / бикарбонатом [16].В соответствии с этими наблюдениями делеция BAS2714-12 не повлияла на транскрипцию atxA (рис. 2С).

Влияние BAS2714-12 на вирулентность в модели in vivo на животных резко: в то время как, как и ожидалось, инфицирование мышей A / J спорами родительского штамма 34F2 быстро привело к обширному отеку с последующей смертью [30], заражение спорами делеционного штамма не показало никаких визуальных признаков инфекции, и все мыши выжили до конца эксперимента (фиг. 6).Эти результаты подтвердили корреляцию между бикарбонат-зависимой индукцией экспрессии гена токсина ex vivo и вирулентностью B. anthracis in vivo . Модель инфекции на мышах A / J была выбрана из-за чувствительности к инфекции продуцирующим токсин штаммом Sterne 34F2 (pXO1 ⁺ pXO2 ^— ). Однако вирулентность в организме человека-хозяина требует экспрессии как токсина, так и капсулы. Экспрессия в капсулах, как и продукция токсинов, индуцируется бикарбонатом [15].Учитывая аналогичную зависимость индуцированной бикарбонатом индукции капсулы как от AtxA, так и от геномных последовательностей [10], [15], вполне вероятно, что делеция BAS2714-12 также устранит индукцию образования капсул и, следовательно, вирулентность полностью вирулентного, штамм, продуцирующий токсины и капсулы.

Бикарбонат, а не CO ₂ , по-видимому, является первичной молекулой, регулирующей индукцию экспрессии гена вирулентности. Если бы CO ₂ был первичной сигнальной молекулой, можно было бы ожидать снижения экспрессии токсина в присутствии ингибитора карбоангидразы, поскольку бикарбонат в растворе больше не может быстро превращаться в CO ₂ внутри клетки.Вместо этого мы наблюдали противоположный феномен: ингибирование активности карбоангидразы влияет только на экспрессию токсина в отсутствие добавленного бикарбоната или когда бикарбонат больше не может быть импортирован в клетку (Рисунок 5), условия, при которых карбоангидраза будет преобразовывать CO ₂ в бикарбонат. Индукция экспрессии токсина ex vivo за счет высоких уровней CO ₂ в атмосфере в отсутствие добавленного бикарбоната, вероятно, является результатом спонтанного или управляемого карбоангидразами преобразования CO ₂ в бикарбонат, что затем сигнализирует об увеличении экспрессии токсина.Сенсорный или метаболический путь, который напрямую реагирует на бикарбонат и индуцирует экспрессию токсинового гена, остается неизвестным, но его идентификация является постоянным центром нашей работы.

Бикарбонат — основной элемент в организме млекопитающих. Он присутствует во всех жидкостях и органах организма и играет важную роль в кислотно-основном гомеостазе. Нормальная концентрация бикарбоната в крови колеблется между 22–26 мМ и его присутствие вместе с угольной кислотой (H ₂ CO ₃ ), ионами водорода и диоксидом углерода образует буферную систему, необходимую для обеспечения устойчивости к резким изменениям в крови. Значения pH.Бикарбонат, выделяемый поджелудочной железой, также регулирует pH в тонком кишечнике, нейтрализуя кислоту, поступающую в двенадцатиперстную кишку из желудка [31], [32]. Таким образом, бикарбонат может быть сигнальной молекулой вирулентности для патогенеза энтеробактерий, а также патогенами, передающимися с кровью.

B. anthracis не единственный среди бактерий, регулирующий экспрессию гена вирулентности в ответ на CO ₂ / бикарбонат. CO ₂ и / или бикарбонат увеличивает выработку токсинов в Vibrio cholerae [33] и Staphylococcus aureus [34], индуцирует экспрессию генов прикрепления в Escherichia coli O157: H7 [35], изменяет антигенный профиль Borrelia burgdorferi [36], и активирует регуляторный белок вирулентности в Citrobacter rodentium [37].В любой из этих систем система транспорта бикарбоната, подобная BAS2714-12, может непосредственно участвовать в транспорте бикарбоната и стимуляции экспрессии фактора вирулентности. Наиболее непосредственное отношение к бикарбонатной регуляции в B. anthracis — это стимуляция антифагоцитотического белка М в Streptococcus pyogenes [38]. Экспрессия М-белка контролируется регуляторным белком Mga, фактором транскрипции, который похож на регуляторный белок B. anthracis AtxA, поскольку он содержит два домена PRD и может регулироваться посредством фосфорилирования / дефосфорилирования через систему утилизации углеводов PTS. [12], [39].Очевидное перекрытие метаболических систем CO ₂ / бикарбонат и регуляция доменов PRD в регуляторных белках в ответ на утилизацию углеводов наводит на мысль о сходных системах транспорта и регуляции бикарбоната между этими патогенными видами. Интересно, что поиск BLAST штамма S. pyogenes M6 (номер доступа NC_006086) с использованием субстрат-связывающего белка BAS2713 в качестве запроса выявил продукт гена Spy1045 как белок с наибольшим сходством (21%) и домен TauA. в его аминоконцевой половине белка.В С-концевой части Spy1045 содержит пермеазный домен ABC-типа (суперсемейство компонентов внутренней мембраны связывающей белковой системы cl00427), который вместе с АТФазным доменом, кодируемым геном Spy1046 (35% идентичности с BAS2714), может составлять переносчик бикарбоната S. pyogenes (рис. 1).

Регулирование фактора вирулентности B. anthracis требует сложного взаимодействия между перекрывающимися метаболическими системами, но впервые мы раскрыли специальные транспортные компоненты пути регуляции CO ₂ / бикарбонат.Это позволило нам напрямую разделить влияние нескольких сигнальных молекул, чтобы обнаружить, что бикарбонат непосредственно ответственен за индукцию in vivo , а также ex vivo , экспрессию фактора вирулентности, которая важна для патогенеза B. anthracis . Примечательно, что доступность трехмерной структуры бикарбонатсвязывающего домена белка CmpA Synechococcus в присутствии и в отсутствие лиганда может быть использована для выявления специфических ингибиторов этого домена и предоставления новых возможностей для антибактериального вмешательства [23].В свете этих результатов исследование регуляции и транспорта бикарбонатов должно иметь гораздо большее значение для большого числа патогенных организмов.

Материалы и методы

Штаммы бактерий и условия роста

B. anthracis Sterne 34F2 (pXO1 ⁺ pXO2 ^— ) и его производные обычно выращивали в бульоне LB с добавлением соответствующих антибиотиков в следующих концентрациях: хлорамфеникол 7.5 мкг / мл, тетрациклин 5 мкг / мл, эритромицин 5 мкг / мл, линкомицин 25 мкг / мл или канамицин 7,5 мкг / мл. 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид (X-Gal) добавляли в конечной концентрации 40 мкг / мл в агар LB для мониторинга активности β-галактозидазы в твердой среде. Все ингибиторы карбоангидразы (Sigma) были свежеприготовлены в ДМСО непосредственно перед добавлением в культуры. Чтобы вызвать экспрессию токсина на высоком уровне, B. anthracis выращивали в чашках с LB-агаром или жидких средах LB, содержащих 0.8% бикарбонат натрия и 100 мМ 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфоновая кислота (HEPES) [pH 8,0] или в R-Media [40] при 5% CO ₂ . Электрокомпетентные клетки B. anthracis получали по методу Koehler et al [18].

Штамм E. coli TG1 использовали для конструирования и размножения плазмиды. Штамм E. coli SCS110 был использован для получения неметилированной ДНК для трансформации в B. anthracis . Трансформация E. coli была проведена электропорацией с использованием импульсного генератора Bio-Rad Gene Pulser согласно заявлению поставщика. Трансформанты отбирали на бульоне LB с добавлением ампициллина (100 мкг / мл), хлорамфеникола (7,5 мкг / мл) или канамицина (30 мкг / мл).

Делеция безмаркерного гена

Делеции гена в B. anthracis были созданы по существу методом Джейнса и Стибица [41]. Область длиной 738 п.н. перед BAS2714 амплифицировали с использованием праймеров BAS2714U5’Bam и BAS2714U3’Sal (таблица S1), тогда как область 828 п.н. ниже BAS2712 амплифицировали с использованием праймеров BAS2712D5’Sal и BAS2712D3’Pst.Затем секвенированные продукты клонировали в термочувствительную плазмиду pORI-I-SceI [42] для получения плазмиды pAW091. Для делеции BAS4675-77 область длиной 624 п.о. перед BAS4675 амплифицировали с использованием праймеров BAS4675U5’Bam и BAS4675U3’Sal, а область 750 п.о. ниже BAS4677 амплифицировали с использованием праймеров BAS4677D5’Sal и BAS4677D5’Pst. Секвенированные продукты также клонировали в плазмиде pORI-I-SceI для получения плазмиды pAW093. Плазмиды pAW091 и pAW093 электропорировали в B.anthracis 34F2 и выращивали при разрешающей температуре 28 ° C в присутствии левомицетина. Затем бактерии переводили на недопустимую температуру 37 ° C в присутствии хлорамфеникола для достижения целевой интеграции плазмиды путем гомологичной рекомбинации. После интеграции плазмиды следовали протоколу Janes и Stibitz [41] для создания безмаркерной делеции. Диагностическая ПЦР была проведена, чтобы убедиться, что вся кодирующая последовательность была правильно удалена. Диагностическая ПЦР также проводилась на геномной ДНК с использованием atxA -специфических праймеров, чтобы гарантировать, что плазмида pXO1 не была потеряна во время процесса (таблица S1).

Анализ комплементации

Область BAS2714-12, включающая область 640 пар оснований выше BAS2714, содержащую потенциальные регуляторные последовательности, амплифицировали с использованием праймеров BAS27145’Xba и BAS27123’Hind и вводили в вектор pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen). После секвенирования вставку удалили расщеплением XbaI-HindIII и лигировали в многокопийный плазмидный вектор pHT315, расщепленный XbaI-HindIII [29], с получением плазмиды pAW144. pAW144, а также векторную плазмиду pHT315, электропорировали в родительские штаммы 34F2 и 34F2ΔBAS2714-12.Диагностическая ПЦР проводилась на геномной ДНК с использованием праймеров, специфичных для atxA , чтобы гарантировать, что плазмида pXO1 не была потеряна во время процесса.

Анализ β-галактозидазы

B. anthracis штаммов, несущих слияния pagA-lacZ [12] или atxA-lacZ (pAtxA12 [17]) на репликативном векторе слияния транскрипции pTCV-lac [25], выращивали при 37 ° C в LB или среда R с добавлением соответствующих антибиотиков. Активность β-галактозидазы определяли, как описано ранее, и удельную активность выражали в единицах Миллера [43], [44].

SDS-PAGE и вестерн-блоттинг

Штаммы B. anthracis выращивали в среде R до приблизительно OD ₆₀₀ 1,0 в течение 8 часов в атмосфере 5% CO ₂ при 37 ° C, и образцы супернатанта выделяли микроцентрифугированием клеточных суспензий. Буфер для образцов SDS добавляли к каждому супернатанту, и образцы кипятили в течение 5 минут и загружали в гели 10% SDS-PAGE. Загруженное количество нормализовали относительно плотности клеток. Гели работали при 30 мА в течение приблизительно 2 часов.Гели переносили на PVDF-мембрану (BioRad) в буфере для переноса (25 мМ трис-основания, 192 мМ глицин, 20% метанол) при 20 В в течение ночи. Мембраны инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре в блокирующем буфере (5% сухое молоко в TBST (20 мМ Tris-HCl pH 7,5, 150 мМ NaCl, 0,1% Tween 20)) с последующим добавлением поликлональных антител защитного антигена, разведенных 1 10 000 фунтов стерлингов. Блоты промывали 5 раз и затем инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с козьими антикроличьими антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (BioRad), разведенными 1-10 000 в блокирующем буфере.После промывания мембраны связывание антител исследовали с помощью набора ECL Plus (GE), и полосы белка визуализировали с помощью PhosphorImager (Molecular Dynamics).

Анализ поглощения бикарбонатов

Ночные культуры штаммов B. anthracis 34F2 и 34F2ΔBAS2714-12 разводили 1 × 100 в среде R без добавления NaHCO ₃ и выращивали в 60 мл стерильных флаконах для культивирования при 37 ° C в атмосфере 5% CO ₂ . Когда культуры достигли ОП ₆₀₀ 0.4, 50 мкКи NaH ¹⁴ CO ₃ (MP Biomedical) добавляли к каждой культуре. Через указанные интервалы времени клетки отделяли от 1 мл культуры вакуумной фильтрацией на стеклянных фильтрах (Millipore) и немедленно промывали 10 мл холодной среды. Затем фильтры помещали в стеклянные флаконы, содержащие 5 мл счетной смеси Bio-Safe II (RPI corp.), И радиоактивность, удерживаемую на фильтре, измеряли в жидкостном сцинтилляционном анализаторе Packard 1600 TR.

Препарат для спор

Б.anthracis Штаммы 34F2 и 34F2ΔBAS2714-12 выращивали в среде для споруляции Шеффера в течение приблизительно 72 часов, пока более 80% спор не стали единичными и свободными по данным фазово-контрастной микроскопии. Клетки собирали центрифугированием при 10000 g в течение 30 минут, среду отсасывали и осадок клеток ресуспендировали в 20 мл стерильной дистиллированной воды. Клетки промывали дважды в день в течение 5 дней центрифугированием при 12000 g и ресуспендированием в 20 мл свежей стерильной воды для удаления большей части вегетативных клеток.Затем осадки клеток ресуспендировали в 20% ренографине (Squibb) и осторожно наслаивали поверх 50% ренографина в центрифужной пробирке Corex на 30 мл. Затем пробирки центрифугировали при 13000 g в течение 30 минут. Супернатант, содержащий вегетативные формы, удаляли и очищенные осадки спор ресуспендировали в 1 мл стерильной воды. Осадки спор промывали дважды в день в течение 3 дней микроцентрифугированием при 14000 об / мин с последующим ресуспендированием осадка спор в 1 мл стерильной воды. Общее количество спор измеряли с помощью гемацитометра, в то время как количество живых спор измеряли серийным разведением с последующим посевом на LB-агар.

Инфекция мыши

самкам мышей A / J в возрасте 6 недель (The Jackson Laboratory) подкожно инъецировали 10 ⁶ спор, очищенных ренографином. Прогрессирование заболевания контролировали визуально в течение 12 дней. Всех мышей содержали и содержали в помещении для животных Научно-исследовательского института Скриппса с одобрения Институционального комитета по уходу за животными и их использованию.

Благодарности

Это рукопись номер 19701 из Исследовательского института Скриппса.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: ACW JAH MP. Проведены эксперименты: ACW MS. Проанализированы данные: ACW JAH MP. Написал статью: ACW JAH MP.

Ссылки

1. 1. Диксон Т.К., Мезельсон М., Гийемин Дж., Ханна П.С. (1999) Anthrax. N Engl J Med 341: 815–826.
2. 2. Okinaka RT, Cloud K, Hampton O, Hoffmaster AR, Hill KK и др. (1999) Последовательность и организация pXO1, большой плазмиды Bacillus anthracis , несущей гены токсина сибирской язвы.J Bacteriol 181: 6509–6515.
3. 3. Дюсбери Н.С., Уэбб С.П., Леппла С.Х., Гордон В.М., Климпель К.Р. и др. (1998) Протеолитическая инактивация МАР-киназы-киназы летальным фактором сибирской язвы. Наука 280: 734–737.
4. 4. Leppla SH (1982) Фактор отека токсина сибирской язвы: бактериальная аденилатциклаза, которая увеличивает концентрацию циклического АМФ в эукариотических клетках. Proc Natl Acad Sci U S A 79: 3162–3166.
5. 5. Milne JC, Furlong D, Hanna PC, Wall JS, Collier RJ (1994) Защитный антиген сибирской язвы образует олигомеры во время интоксикации клеток млекопитающих.J Biol Chem 269: 20607-20612.
6. 6. Дрисдейл М., Хенингер С., Хатт Дж., Чен И., Лайонс С.Р. и др. (2005) Синтез капсулы Bacillus anthracis необходим для распространения ингаляционной сибирской язвы у мышей. EMBO J 24: 221–227.
7. 7. Makino S, Uchida I, Terakado N, Sasakawa C, Yoshikawa M (1989) Молекулярная характеристика и анализ белка области кэпа, которая необходима для инкапсуляции в Bacillus anthracis . J Bacteriol 171: 722–730.
8. 8. Candela T, Mock M, Fouet A (2005) CapE, пептид из 47 аминокислот, необходим для синтеза полиглутаматной капсулы Bacillus anthracis . J Bacteriol 187: 7765–7772.
9. 9. Dai Z, Sirard JC, Mock M, Koehler TM (1995) Продукт гена atxA активирует транскрипцию генов токсина сибирской язвы и необходим для вирулентности. Mol Microbiol 16: 1171–1181.
10. 10. Uchida I, Makino S, Sekizaki T, Terakado N (1997) Перекрестный разговор с генами синтеза капсулы Bacillus anthracis с помощью atxA , гена, кодирующего trans -активатор синтеза токсина сибирской язвы.Мол микробиол 23: 1229–1240.
11. 11. Saile E, Koehler TM (2002) Контроль экспрессии гена токсина сибирской язвы с помощью регулятора переходного состояния abrB . J Bacteriol 184: 370–380.
12. 12. Цветанова Б., Уилсон А.С., Бонджорни С., Чианг С., Хох Дж. А. и др. (2007) Противоположные эффекты фосфорилирования гистидина регулируют фактор транскрипции вирулентности AtxA в Bacillus anthracis . Mol Microbiol 63: 644–655.
13. 13. Sterne M (1937) Вариация Bacillus anthracis .Onderstepoort J Vet Sci Anim Ind 8: 271–349.
14. 14. Sirard JC, Mock M, Fouet A (1994) Три гена токсина Bacillus anthracis координированно регулируются бикарбонатом и температурой. J Bacteriol 176: 5188–5192.
15. 15. Fouet A, Mock M (1996) Дифференциальное влияние двух плазмид Bacillus anthracis на регуляцию экспрессии гена вирулентности. Infect Immun 64: 4928–4932.
16. 16. Dai Z, Koehler TM (1997) Регулирование экспрессии гена активатора токсина сибирской язвы ( atxA ) в Bacillus anthracis : температура, а не CO2 / бикарбонат, влияет на синтез AtxA.Инфекция иммунной 65: 2576–2582.
17. 17. Бонджорни С., Фукусима Т., Уилсон А.С., Чанг К., Мансилла М.С. и др. (2008) Двойные промоторы контролируют экспрессию фактора вирулентности Bacillus anthracis AtxA. J Bacteriol 190: 6483–6492.
18. 18. Koehler TM, Dai Z, Kaufman-Yarbray M (1994) Регулирование гена защитного антигена Bacillus anthracis : CO2 и транс-действующий элемент активируют транскрипцию с одного из двух промоторов. J Bacteriol 176: 586–595.
19. 19. Uchida I, Hornung JM, Thorne CB, Klimpel KR, Leppla SH (1993) Клонирование и характеристика гена, продукт которого является трансактиватором синтеза токсина сибирской язвы. J Bacteriol 175: 5329–5338.
20. 20. Кейси-младший (2006) Почему бикарбонат? Biochem Cell Biol 84: 930–939.
21. 21. Омата Т., Прайс Г.Д., Барсук М.Р., Окамура М., Гохта С. и др. (1999) Идентификация АТФ-связывающего кассетного транспортера, участвующего в захвате бикарбоната цианобактериями Synechococcus sp., штамм PCC 7942. Proc Natl Acad Sci U S. A 96: 13571–13576.
22. 22. Барсук М.Р., Прайс Г.Д. (2003) Механизмы концентрации СО2 в цианобактериях: молекулярные компоненты, их разнообразие и эволюция. J Exp Bot 54: 609–622.
23. 23. Коропаткин Н.М., Коппенаал Д.В., Пакраси Х.Б., Смит Т.Дж. (2007) Структура цианобактериального транспортного белка бикарбоната, CmpA. J Biol Chem 282: 2606–2614.
24. 24. Коропаткин Н.М., Пакраси Х.Б., Смит Т.Дж. (2006) Атомная структура нитрат-связывающего белка, имеющая решающее значение для продуктивности фотосинтеза.Proc Natl Acad Sci U S A 103: 9820–9825.
25. 25. Poyart C, Trieu-Cuot P (1997) Мобильный челночный вектор с широким кругом хозяев для конструирования транскрипционных слияний с β-галактозидазой в грамположительных бактериях. FEMS Microbiol Lett 156: 193–198.
26. 26. Welkos SL, Keener TJ, Gibbs PH (1986) Различия в восприимчивости инбредных мышей к Bacillus anthracis. Заражение иммунной 51: 795–800.
27. 27. Perego M, Hoch JA (2008) Объединение регуляторных систем после приобретения плазмид вирулентности Bacillus anthracis .Trends Microbiol 16: 215–221.
28. 28. van der Ploeg JR, Barone M, Leisinger T (2001) Экспрессия генов утилизации сульфонат-сера Bacillus subtilis регулируется на уровнях инициации и терминации транскрипции. Мол микробиол 39: 1356–1365.
29. 29. Arantes O, Lereclus D (1991) Конструирование векторов клонирования для Bacillus thuringiensis . Ген 108: 115–119.
30. 30. Duong S, Chiaraviglio L, Kirby JE (2006) Гистопатология в мышиной модели сибирской язвы.Инт. Ж. Эксп. Патол 87: 131–137.
31. 31. Ван Слайк Д.Д. (1922) Исследования ацидоза. XVIII. Определение концентрации бикарбонатов в крови и плазме. J Biol Chem 52: 495–499.
32. 32. Barrett DH (2003) Кислотно-щелочной баланс и интерпретация результатов анализа газов крови. Обновления в Анестезии 16: Статья 2.
33. 33. Иванага М., Ямамото К. (1985) Новая среда для продукции холерного токсина Vibrio cholerae O1 биотипа Эль Тор.J Clin Microbiol 22: 405-408.
34. 34. Росс Р.А., Ондердонк А.Б. (2000) Производство токсина 1 синдрома токсического шока с помощью Staphylococcus aureus требует как кислорода, так и углекислого газа. Infect Immun 68: 5205–5209.
35. 35. Abe H, Tatsuno I, Tobe T, Okutani A, Sasakawa C (2002) Ион бикарбоната стимулирует экспрессию локуса генов, кодируемых сглаживанием энтероцитов, в энтерогеморрагической Escherichia coli O157: H7. Заражение иммунной 70: 3500–3509.
36. 36. Hyde JA, Trzeciakowski JP, Skare JT (2007) Borrelia burgdorferi изменяет экспрессию своих генов и антигенный профиль в ответ на уровни CO2. J Bacteriol 189: 437–445.
37. 37. Ян Дж., Харт Э., Таушек М., Прайс Г. Д., Хартланд Э. Л. и др. (2008) Опосредованная бикарбонатом активация транскрипции дивергентных оперонов регуляторным белком вирулентности RegA из Citrobacter rodentium . Mol Microbiol 68: 314–327.
38. 38.Caparon MG, Geist RT, Perez-Casal J, Scott JR (1992) Регулирование вирулентности в среде стрептококков группы A : транскрипция гена, кодирующего белок M, стимулируется углекислым газом. J Bacteriol 174: 5693–5701.
39. 39. Hondorp ER, McIver KS (2007) Реглон вирулентности Mga: инфекция там, где трава зеленее. Мол микробиол 66: 1056–1065.
40. 40. Ristroph JD, Ivins BE (1983) Разработка антигенов Bacillus anthracis в новой определенной культуральной среде.Заражение иммунной 39: 483–486.
41. 41. Джейнс Б.К., Стибиц С. (2006) Обычная безмаркерная замена гена в Bacillus anthracis . Инфекция иммунной 74: 1949–1953.
42. 42. Bongiorni C, Stoessel R, Perego M (2007) Отрицательная регуляция споруляции Bacillus anthracis семейством фосфатаз Spo0E. J Bacteriol 189: 2637–2645.
43. 43. Миллер Дж. Х. (1972) Эксперименты в молекулярной генетике. Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк: Лаборатория Колд-Спринг-Харбор.С. 352–355.
44. 44. Wilson AC, Hoch JA, Perego M (2008) Экспрессия гена вирулентности не зависит от регулируемого ResDE контроля дыхания в Bacillus anthracis . J Bacteriol 190: 5522–5525.
45. 45. Maeda S, Omata T (1997) Субстрат-связывающий липопротеин цианобактерии Synechococcus sp. штамм PCC 7942 участвует в транспорте нитратов и нитритов. J Biol Chem 272: 3036–3041.

«Транспортер — как форсаж, все взрослые»

«Транспортер » — каскадерская хореография и автомобильные погони — были настолько хороши, что положили начало карьере Джейсона Стэтхэма и заставили меня в подростковом возрасте купить BMW.Я не уверен, что было более значительным вкладом в культуру. Ты будешь судьей.

(Добро пожаловать в Jalopnik Movie Club , где мы смотрим на автомобили в фильмах и фильмы об автомобилях, и вы пишете все свои горячие моменты. На этой неделе мы рассматриваем The Transporter , фильм о том, как это круто, если вы незаконно перевозите вещи, если это не контейнер, полный людей, и вы не главный герой.)

Я вырос в том, что мне нравится считать ренессансом боевиков, с отличными фильмами как The Bourne Identity , The Matrix , Hero , The Boondock Saints , Миссия невыполнима , GoldenEye , Ronin , Charlie’s Angels , And The Fast, Furious , Blade , Kill Bill и многие другие.Да, в 80-е было Крепкий орешек, Робокоп, Пришельцы, Терминатор и еще больше, но это было следующее десятилетие, когда мы действительно потеряли это дерьмо, прежде чем франшизы о супергероях и волшебниках полностью доминировали в кино.

Но одним из краеугольных камней моего детского просмотра фильмов был The Transporter, фильм 90-х годов, за исключением года его выхода, то есть 2002 года.

Моей первой машиной была Honda Civic Coupe 2007 года выпуска с автоматической коробкой передач. на выбор сильно повлияли мои родители.Как только я стал помощником менеджера сети быстрого питания, над которой я работал в возрасте 17 лет (навыки, которые естественным образом переводятся в работу в ночную смену на Ялопнике), я бросил этот Civic на BMW 325ci 2003 года выпуска с ручным управлением, удовлетворив свою, по общему признанию, скромную. мечтаю о владении бмв. У меня было, черт возьми, превратилось в .

G / O Media может получить комиссию

Эта мечта частично родилась из фильмов Пирса Броснана о Джеймсе Бонде, где Бонд водил Z3, 7 Series, а затем Z8, и еще большее влияние на меня оказал The Transporter 735i.Как ни странно, переход на Audi в более поздних фильмах не оказал большого влияния.

Насколько хороша сама по себе серия E38 7, Transporter действительно помогает ее продать. Мало того, что Фрэнк Мартин, сказал Транспортер, явно крутой парень, фильм также старается показать, насколько он ценит и уважает свою машину, постоянно поддерживая ее в чистоте и должным образом настроенной. Обработка автомобиля в фильме произвела на меня большее впечатление, чем если бы я просто увидел проезжающую по улице.

Фрэнк тоже умеет на нем водить. Последовательность начального ограбления банка не только подтверждает его навыки, но и демонстрирует, насколько хорошо E38 выглядит под низким углом, как здорово он звучит, когда вы набираете обороты, насколько полезным может быть управление неэффективным исполнительным седаном и как Глупый этот фильм готов быть с манерным французским полицейским и неудобным прыжком с моста.

Если вы не в курсе, The Transporter рассказывает о бывшем военном по имени Фрэнк, одержимом своими собственными придуманными правилами, который терроризирует Францию, перевозя практически все, что угодно, на его модном BMW.На второй работе в фильме он нарушает свои собственные правила и попадает в ловушку, пытаясь остановить заговор с целью переправить 400 человек в Европу в транспортном контейнере.

Если вернуться к этому фильму, откроется новый слой комедии, который я не помнил в детстве. Очевидно, французский инспектор всегда был великолепен, но есть некоторые сцены, которые я пропустил, например, когда Фрэнк практически вырывается из бирюзовой рубашки-поло, свободных белых слаксов и сандалий и пытается серьезно поговорить с Лаем о том, что кучка людей продано в контейнере для хранения, и все это, я думаю, на самом деле предназначено для смеха, учитывая, что он украл одежду.Или есть сцена, в которой Лай пытается всерьез сказать, что у Джейсона Стэтхэма было «доброе лицо», когда она лгала о том, что подобрала его ночью на обочине дороги.

Этот фильм также имеет стильный оттенок помимо великолепной хореографии, такой как использование «трассирующих» снарядов каждый раз, когда стреляет ружье, некоторые нестандартные ракурсы, несколько захватывающих сцен действия и абсолютно невероятный саундтрек, который все, вероятно, учтено в том, насколько впечатлительным я был в детстве в этом фильме.Сцена драки на вилле после взрыва его машины до сих пор одна из лучших, которые я когда-либо видел.

К сожалению, взросление также показало новый неприятный свет на жестокое обращение с Лаем практически всеми в этом фильме, насколько странной является сцена, где Фрэнк отбивается от группы парней, покрывая свое голое тело маслом, как ленивая часть развития сюжета, и я полностью забыл финал, в основном потому, что он не приземляется с каким-либо существенным воздействием после того, как последовательность боевых действий грузовика явно поднята из Raiders Of The Lost Ark .

В конечном счете, Transporter — это лысый парень средних лет, который много ездит на BMW, что звучит как история среднего владельца BMW, но превращается в фаст-фуд из боевика с промасленными … кулачные бои, отличные погони, забавные персонажи и впечатляющие трюки.

По сути, это как The Fast And The Furious , но для человека, который заботится о немецком представительском седане в своем гараже так же, как подросток заботится о своей разбитой Mazda RX7.И может быть 401 (k).

Я иду послушать саундтрек к этому фильму, так что это все от меня. Теперь давайте послушаемся тех из вас, кто прислал по электронной почте свои мысли, мнения и горячие мысли о The Transporter :

Jalopnik Заместитель редактора Майкл Баллабан:

Как вы хорошо знаете, я глубоко уважаю и восхищаюсь всем, что вы делаете. Я уверен, что идеальные и прекрасные читатели, которым нравится серия фильмов Jalopnik Movie Club, чувствуют то же самое.

Вы недавно говорили о Transporter в офисе.Я, как и этот отвратительный занудный человек, сразу же вмешался в разговор, который у вас был с Кристен, и грубо пожаловался на то, что BMW 7 серии в фильме на самом деле не существовало. Ну, вроде как. Только для фильма. Вы сказали мне послать вам этот маленький фактоид по электронной почте.

Вот тот факт.

Автомобиль, использованный в фильме, был BMW 750il с двигателем V12, согласно TheTransporterMovie.net , но оснащенный механической коробкой передач от BMW для «боевых» целей (в фильме его называли 735i, но предположительно он действительно была модель V12).BMW так и не выпустила другого механического двигателя V12 7-й серии. Но они должны были это сделать.

Ладно, вот и все.

Всегда с любовью и благословениями,

Ballaban

Роберт Х .:

Я подумал, что фильм отлично справился с изображением настоящих спальных машин. Негабаритные немецкие седаны с несколькими сделанными со вкусом модификациями. Позже в сериале он попадает на территорию Bond Q Branch, но наблюдать за тем, как Audi переворачивается в оригинале, было потрясающе.

От фильма под названием Transporter я ожидал большего вождения. Но, чтобы компенсировать отсутствие визга шин на поворотах, к счастью, сценаристы порадовали нас множеством милых хореографических боев. Как только вы снизите свои ожидания, этот фильм станет таким, какой он есть на самом деле, просто приличным боевиком, и вы будете рады, что не потратили свои деньги в 2002 году.

Не поймите меня неправильно, Фрэнк Мартин, который авторы сочинили апелляции к моему сдержанному ОКР. Водитель, который держит свою машину в чистоте, тщательно следит за расписанием, одевается в хорошо сидящую одежду и обладает некоторыми навыками вождения.Это полностью моя сумка. Вероятно, помогает то, что Стэтхэм имеет мимолетное сходство с мистером Клином.

Но после того, как его БМВ взорвался, и он сел на Мерседес, а затем на другие маленькие французские автомобили, я чуть не заснул от того, насколько это было предсказуемо.

Мне особенно понравились боевые сцены. В некотором смысле Стэтхэм был почти как Джеки Чан или Джет Ли из бедняков, с тем, насколько творчески он проявлял себя в окружении превосходящих людей. Если бы вы сказали мне, что во вторник вечером я бы наблюдал за тем, как дюжина мужчин смазывают себя маслом, я бы рассмеялся, но Стэтхэм делает почти правдоподобным наблюдение типа: «Да, это совершенно правдоподобно.

И ему столько раз приходилось снимать рубашку? Это похоже на то, как если бы у Стэтхэма был наездник, которого нужно показывать без рубашки хотя бы две минуты экранного времени, иначе он ходит.

Exage03040:

В этом фильме мы видим следующее: женщина пьет через соломинку, мужчина ест руками, а инспектор пьет из чашки.

«Chacun voit midi à sa porte…» Я по-другому вспомнил «Транспортер», когда впервые увидел его много лет назад. Этот фильм, в частности, закрепил за собой боевик Джейсона Стэтхэма.Это было его происхождением, поскольку я впервые стал свидетелем его боевых искусств. Хотя это странно. Я помню, как был очарован этим фильмом, когда впервые посмотрел его. И все же этот конкретный просмотр я был довольно шокирован. Думаю, он поразил меня в подходящем возрасте, когда он был выпущен, потому что это не совсем хороший фильм.

Джейсон играет жесткого колесника Фрэнка Мартина; Перевозчик, который доставит что угодно и где угодно, всего лишь с несколькими вопросами и крупной оплатой. Раньше я вспоминал Фрэнка как этого загадочного и крутого персонажа, но теперь он кажется чрезвычайно одномерным.После, возможно, трофеи многих фильмов Стэтхэма. К сожалению, большинство персонажей страдают стереотипными комплексами и довольно съеживаются от достойных выступлений, за исключением Франсуа Берлеана в роли инспектора Таркони. Я все еще верю, что он выполнил свою роль.

BMW 7-й серии поляризует этот фильм. С модификациями трюков и руководством для загрузки! Он очень хорошо представлен на экране, и я считаю, что это был лучший способ описать личность Фрэнкса аудитории, несмотря на то, что это был неясный способ добиться этого.Сам по себе автомобильный экшен определенно уравновешен по сравнению с взрывными фильмами, которые развивались в стиле «Быстрого и смешного». Как бы то ни было, в фильме есть несколько хороших сцен и сценариев в этой области, и это, безусловно, было приемлемо для своей эпохи.

По общему признанию, мне нравится посылка, но в большой схеме сюжет находится на странной стороне с такими же странными встречами. Всегда кажется, что выбирают план Б или В, потому что судороги позволяют более интересным боям или побегам.Эти велосипедные педали — чистое волшебство на этом смазанном маслом полу! Так же и фермер с идеальным самолетом для прыжков с парашютом [и парашютом]. Не забудем также Metal Gear Solid Nikita, похожий на ракету, которая взрывает печь в доме Франков. Я полагаю, «Impossible n’est pas français».

Movie: Это одна из ранних работ Стэтхэма, и она показывает ускоренные сцены боя, быстрые монтажные кадры и довольно деревянную игру. Это фильм, который, как мне кажется, не выдержал так хорошо, и в целом он не был особенно сильным.C это так.

Car Movie: В нем есть приличный выбор и сценарии с участием транспортных средств. Это не совсем звездно в этом плане, поскольку различные сцены вызывают заметные перебои в отношении транспортных средств. Тем не менее, черный BMW 7 был фантастическим выбором. Я поставлю ему B.

Rude Negro:

The Transporter — Чертовски хороший фильм.

И это завершает обзор Jalopnik Movie Club на этой неделе! Спасибо всем, кто написал свои дубли, и я призываю вас сделать это на следующей неделе!

На следующей неделе мы рассмотрим Чувак, где моя машина? , который, вероятно, все видели, но, к сожалению, доступен только для аренды или покупки.В любом случае, соберитесь с мыслями и напишите свое мнение и горячие моменты Джастину на jalopnik dot com.

А пока не расскажите о достоинствах и недостатках Transporter и всей его безнадежности, и до встречи на следующей неделе!

MacB ABC транспортер представляет собой димер, активность АТФазы и макролидсвязывающая способность которого регулируются мембранным гибридным белком MacA

Грамотрицательные бактерии используют специализированные механизмы для перемещения лекарств и белковых токсинов через внутреннюю и внешнюю мембраны, состоящие из трех частей. комплекс, состоящий из вторичного или первичного активного переносчика внутренней мембраны (IMP), слитого белка периплазматической мембраны и канала внешней мембраны.Мы исследовали сборку и функцию системы MacAB / TolC, которая придает устойчивость к макролидам в Escherichia coli . Слитый с мембраной белок MacA не только стабилизирует трехкомпонентную сборку, взаимодействуя как с белком внутренней мембраны MacB, так и с белком внешней мембраны TolC, но также играет роль в регулировании функции MacB, очевидно, увеличивая его сродство как к эритромицину, так и к АТФ. Анализ кинетического поведения гидролиза АТФ показал, что MacA способствует и стабилизирует АТФ-связывающую форму переносчика MacB.С помощью недиссоциирующей масс-спектрометрии, аналитического ультрацентрифугирования и атомно-силовой микроскопии мы впервые однозначно установили димерную природу неканонического переносчика ABC, MacB, который имеет N-концевой нуклеотид-связывающий домен. Структурные исследования транспортеров ABC показывают, что АТФ связывается между парой нуклеотидсвязывающих доменов, чтобы стабилизировать конформацию, в которой сайт связывания субстрата обращен наружу. Следовательно, наши данные предполагают, что в присутствии АТФ такая же конформация MacB продвигается и стабилизируется MacA.Таким образом, MacA будет способствовать доставке лекарств посредством MacB к TolC, усиливая связывание лекарств с ним и индуцируя конформацию MacB, которая примирована и компетентна для связывания TolC. Наши структурные исследования — важный первый шаг в понимании того, как собирается трехчастный комплекс.