Сульфат аммония очищенный: Сульфат аммония очищенный — Росхим

Содержание

Производители сульфата аммония из России

Продукция крупнейших заводов по изготовлению сульфата аммония: сравнение цены, предпочтительных стран экспорта.

  1. где производят сульфат аммония
  2. ⚓ Доставка в порт (CIF/FOB)

Страны куда осуществлялись поставки из России 2018, 2019, 2020, 2021

  • 🇹🇷 ТУРЦИЯ (124)
  • 🇻🇳 ВЬЕТНАМ (76)
  • 🇧🇷 БРАЗИЛИЯ (61)
  • 🇰🇿 КАЗАХСТАН (47)
  • 🇱🇹 ЛИТВА (31)
  • 🇺🇦 УКРАИНА (26)
  • 🇭🇺 ВЕНГРИЯ (12)
  • 🇮🇩 ИНДОНЕЗИЯ (8)
  • 🇰🇬 КИРГИЗИЯ (8)
  • 🇵🇱 ПОЛЬША (7)
  • 🇷🇴 РУМЫНИЯ (6)
  • 🇵🇭 ФИЛИППИНЫ (6)
  • 🇲🇩 МОЛДОВА, РЕСПУБЛИКА (6)
  • 🇹🇲 ТУРКМЕНИЯ (6)
  • 🇹🇯 ТАДЖИКИСТАН (6)

Выбрать сульфат аммония: узнать наличие, цены и купить онлайн

Крупнейшие экспортеры из России, Казахстана, Узбекистана, Белоруссии, официальные контакты компаний. Через наш сайт, вы можете отправить запрос сразу всем представителям, если вы хотите купить сульфат аммония.


🔥 Внимание: на сайте находятся все крупнейшие российские производители сульфата аммония, в основном производства находятся в России. Из-за низкой себестоимости, цены ниже, чем на мировом рынке

Поставки сульфата аммония оптом напрямую от завода изготовителя (Россия)

Крупнейшие заводы по производству сульфата аммония

Заводы по изготовлению или производству сульфата аммония находятся в центральной части России. Мы подготовили для вас список заводов из России, чтобы работать напрямую и легко можно было купить сульфат аммония оптом

Сульфат аммония

Изготовитель Квасцы

Поставщики двойные соли и смеси сульфата аммония и нитрата аммония

Крупнейшие производители Книги

Экспортеры Среды культуральные готовые для выращивания или поддержания жизнедеятельности микроорганизмов (включая вирусы и подобные) или клеток растений

Компании производители шлаковата

Производство Шампуни

Изготовитель соли неорганических кислот или пероксокислот

Поставщики Фториды

Крупнейшие производители —

Экспортеры составы огнезащитные

Компании производители Реагенты диагностические или лабораторные на подложке

Производство Аммиак в водном растворе

Сульфат аммония

Сульфат аммония

Аммоний сернокислый технический

есть в наличии

CAS №

7783-20-2

ТУ


TУ 113-03-10-18-91

Формула

(Nh5)2SO4

Сорт

Сорт 1

Синонимы

аммония сульфат

Фасовка

50 кг

Цена

  

Применение

Марка, А (очищенный сульфат аммония) — для пищевой и медицинской промышленности.

Марка Б (технический сульфат аммония) — для кожевенно-обувной, текстильной, электротехнической и других отраслей промышленности.

Транспортировка, хранение

Хранится в закрытых складских помещениях, защищающих продукт от попадания влаги. Транспортируется всеми видами транспорта в крытых транспортных средствах в соответствии с Правилами перевозок грузов.

Гарантийный срок хранения

Гарантийный срок хранения — 6 месяцев со дня изготовления.

Наименование показателя

Значение

Марка А

Марка Б

Первый сорт

Второй

сорт

Внешний вид

Белые или слабо окрашенные кристаллы

Кристаллы

Массовая доля основного вещества в сухом продукте, %, не менее: в пересчете на сульфат аммония в пересчете на азот

9921

9821

9620

Массовая доля воды, %, не более

0,8

0,8

0,8

Массовая доля хлоридов, %, не более

0,002

Не норм.

Не норм.

Массовая доля железа, %, не более

0,007

Не норм.

Не норм.

Массовая доля мышьяка, %, не более

0,00005

Не норм.

Не норм.

Массовая доля нерастворимого в воде остатка, %, не более

0,01

Не норм.

Не норм.

Массовая доля нитритов и нитратов в пересчете на NO3, %, не более

0,001

Не норм.

Не норм.

Массовая доля веществ, восстанавливающих марганцовокислый калий, см3 раствора с (1/5 КМпО4) = 0,002 моль/дм3 (0,01 н), не более

7

Не норм.

Не норм.

Массовая доля роданидов (CNS), %, не более

0,005

Не норм.

Не норм.

Массовая доля тяжелых металлов сероводородной группы (РЬ), %, не более

0,0005

Не норм.

Не норм.

Массовая доля остатка после прокаливания, %, не более

0,05

Не норм.

Не норм.

По вопросам приобретения обращаться по тел.  (831)259-89-00

 (831)259-89-04

Производство сульфата аммония

Сульфат аммония (NH4)2SО4 — бесцветное кристаллическое вещество, содержит 21,21 % азота. Сульфат аммония применяют почти исключительно в качестве удобрения; он обладает весьма небольшой гигроскопичностью, мало слеживается, внесение его в почву не вызывает затруднений. Недостатками являются низкое содержание азота и большая физиологическая кислотность. При его применении в почве, если она не содержит достаточного количества оснований, постепенно накапливается серная кислота, для нейтрализации которой необходимо периодически производить известкование.

Физико-химические основы получения сульфата аммония

Промышленные способы получения сульфата аммония в основном базируются на нейтрализации серной кислоты аммиаком. Для этой цели используют аммиак, содержащийся в газе, получаемом при коксовании каменных углей. Очистка коксового газа от аммиака (и одновременно от пиридиновых оснований) совмещается с производством сульфата аммония. Синтетический аммиак перерабатывают в более концентрированные азотные удобрения, например в нитрат аммония или в карбамид.

Нейтрализация серной кислоты газообразным аммиаком по реакции:

2NH3(г) + H2SО4(ж) = (NH4)2SО4(тв) + 274 кДж

сопровождается выделением большого количества теплоты. Эта теплота (в сатураторном процессе) и теплота, подводимая извне (в бессатураторном процессе), расходуется на испарение из системы значительного количества воды и продукт кристаллизуется из пересыщенного раствора. Важно обеспечить кристаллизацию из горячего реакционного раствора средней соли, не допуская выделения кислых солей.

Находящиеся в серной кислоте примеси, особенно сульфаты железа и алюминия, затрудняют кристаллизацию сульфата аммония. При нейтрализации кислоты осаждаются коллоидные гидроксиды железа и алюминия:

(Fe, Al)2(SO4)3 + 6NH3 + 6H2O = 2(Fe, Al)(OH)3 + 3(NH4)2SО4

обволакивающие кристаллы сульфата аммония и тормозящие их рост. Во избежание этого кислоту нейтрализуют не полностью — в непрерывно действующих реакторах поддерживают кислую реакцию среды.

Участки кривых соответствуют насыщению раствора: 1 – (Nh5)2SО4;
2 – 4(Nh5)2SО4∙Н2SО4; 3 – 3(Nh5)2SО4∙Н2SО4; 4 – (Nh5)2SО4 ∙ Н2SО4;
5 – (Nh5)2SО4 ∙ 3Н2SО4
Рисунок 1 – Изотермы растворимости в системе (Nh5)2SО4—Н2SО4—Н2О при температурах 10, 30, 50, 70 и 90 °С

В этой системе в твердой фазе могут существовать различные кислые соли. Поле кристаллизации сульфата аммония (NH

4)2SО4лежит в области составов систем, содержащих небольшие количества серной кислоты – а1Е1с при температуре 10 °С и а2Е2с при температуре 90 °С. Во избежание выделения кислых солей содержание серной кислоты в жидкой фазе системы должно быть меньше, чем в точках Е, т. е. меньше 11,08 % при температуре 10 °С или 19,77 % при температуре 90 °С. В процессе нейтрализации реакционная масса имеет высокую температуру, но при последующем отделении кристаллов она охлаждается и это необходимо учитывать при выборе состава реакционного раствора. Практически кислотность раствора поддерживают на уровне 4-12 % свободной серной кислоты, распределяя серную кислоту в значительном количестве циркулирующего реакционного раствора.

Технологическая схема производства сульфата аммония

Основным сырьевым источником в производстве сульфата аммония является аммиак коксового газа. В коксовом газе содержится 6-14 г/м3 аммиака. Его можно переработать в сульфат аммония тремя способами: косвенным, прямым и полупрямым.

По косвенному способу коксовый газ охлаждают, при этом из него конденсируется смола и надсмольная вода, насыщенная аммиаком; оставшийся в газе аммиак поглощают водой в аммиачных скрубберах. Из полученной аммиачной воды и из надсмольной воды отгоняют аммиак в дистилляционных колоннах, который затем поглощают серной кислотой. Этот способ требует громоздкого оборудования и значительного расхода энергии.

По прямому способу поглощение аммиака серной кислотой с образованием сульфата аммония производят непосредственно из коксового газа, предварительно охлажденного до температуры 68 °С и очищенного от смолы в электрофильтрах.

Наиболее экономичен и широко распространен полупрямой способ. Коксовый газ для конденсации смолы сначала охлаждают до температуры 25-30 °С. Конденсат расслаивается на два слоя: нижний — смолу и верхний — надсмольную воду, в которой растворена часть аммиака. Надсмольную воду обрабатывают в дистилляционной колонне известковым молоком и выделившийся аммиак поглощают серной кислотой вместе с аммиаком, оставшимся в доочищенном в электрофильтрах от смолы коксовом газе.

Поглощение аммиака из коксового газа можно производить в сатураторах барботажного типа (сатураторный способ) или в скрубберах (бессатураторный способ). В сатураторном способе поглощение аммиака из коксового газа и кристаллизация сульфата аммония совмещены в одном аппарате — сатураторе. Это ограничивает возможность выбора технологического режима, который был бы оптимальным одновременно для обоих процессов, т. е. обеспечивающего наиболее полное поглощение аммиака и образование крупнокристаллического сульфата аммония, легко отделяемого и отмываемого от маточного раствора. В бессатураторных способах, используемых на некоторых заводах, эти процессы ведут раздельно — поглощение аммиака в скрубберах, а кристаллизацию сульфата аммония — в кристаллизаторах.

Схема производства сульфата аммония сатураторным способом

Коксовый газ, охлажденный до температуры 25-30 °С и очищенный от смолы, поступает в подогреватель 1, где нагревается глухим паром до температуры 60-80 °С. Подогретый газ смеши­вается с аммиаком, полученным при переработке надсмольной воды, и направляется по барботажной трубе 5 в сатуратор 4.

Газ барботирует через 78 %-ный раствор серной кислоты, при этом образуется сульфат аммония:

2NH3 + H2SО4 = (NH4)2SО4

В сатураторе одновременно с образованием сульфата аммония из газа извлекаются пириди­новые основания, образующие с серной кислотой комплексные соединения. Они разла­гаются при температуре выше 65 оС с выделением пиридина, который удаляется из сатуратора вместе с газом. Тепло, необходимое для испарения избыточной влаги из образовавшегося раствора сульфата аммония, подводится в сатуратор с коксовым газом, подогретым в аппарате 1.

По выходе из сатуратора газ направляется в ловушку 2 для отделения от брызг кислоты, затем охлаждается и передается на дальнейшее использование. Когда кислот­ность раствора в сатураторе снижается до 6-8 % (что соответствует содержанию в нем 140-170 г/л связанного аммиака), из раствора начинают выделяться кристаллы суль­фата аммония. Образующаяся пульпа центробежным насосом перекачивается в кри­сталлоприемник 8. Маточный раствор из верхней части кристаллоприемника перели­вается в приемный сосуд 6 и возвращается в сатуратор. Кристаллы сульфата аммония непрерывно поступают из кристаллоприемника в центрифугу 7, где отделяются от маточного раствора. Отфугованные кристаллы сульфата аммония, имеющие влажность около 2 %, передают на склад или направляют па сушку.

Часть раствора непрерывно циркулирует между сатуратором и баком 3. Благо­даря циркуляции и непрерывному перекачиванию пульпы из сатуратора в кристаллоприемник с возвратом маточного раствора в сатуратор в нем обеспечивается постоян­ный.уровень жидкости и ее тщательное перемешивание. Поэтому кристаллы соли все время находятся во взвешенном состоянии, и рост кристаллов происходит равномерно во всей массе раствора.

Содержание свободной серной кислоты в маточном растворе, циркулирующем в сатураторе, должно быть в пределах 6-8 %. При понижении кислотности (до 1-2 %) из раствора выпадают более крупные кристаллы, что может вызвать забивку сатуратора солью; при этом также ухудшается поглощение аммиака из газа. С повышением кислотности раствора увеличивается растворимость в нем сульфата аммония и получаются более мелкие кристаллы. Если в растворе содержится более 11 % кислоты, обра­зуется легкорастворимый в воде бисульфат аммония NH4HSО4.

На получение 1 т сульфата аммония затрачивают: 0,73-0,75 т серной кислоты (100 %-й), 0,26-0,27 т аммиака (содержащегося в 30-35 тыс.м3 коксового газа), 100-108 МДж электроэнергии, 8 м3 воды и 2,7-6 т пара.

К недостаткам сатураторного способа, помимо малого размера получаемых кристаллов, сильно пылящих при сушке, относится и большой расход энергии на преодоление гидравлического сопротивления абсорберов. Этих недостатков лишены бессатураторные способы.

В бессатураторных процессах абсорбцию аммиака из коксового газа ведут в полых скрубберах или кислым ненасыщенным раствором сульфата аммония с последующей вакуум-выпаркой на кристалл, или кислым насыщенным раствором с выращиванием образовавшихся мелких кристаллов в кристаллизаторах под атмосферным давлением. Чаще используют первый способ — орошение абсорбера ненасыщенным раствором предотвращает их засоление, а кристаллизация в выпарных аппаратах позволяет регулировать размеры получаемых кристаллов. Схема такого процесса показана на рисунке.

Схема производства сульфата аммония бессатураторным способом с вакуум-выпаркой

Аммиак улавливается в полом скруббере 2, снабженном форсунками. Скруббер разделен на две ступени. Нижняя его часть орошается раствором, содержащим 3-4 % свободной Н2SО4, верхняя — раствором, содержащим 10 — 12 % Н2SО4. Коксовый газ из скруббера проходит через ловушку брызг 1 и направляется на дальнейшую переработку. Серная кислота и вода (необходимая для разбавления и компенсации испарения) поступают в сборник 4 раствора, циркулирующего через верхнюю часть скруббера с помощью насоса 5. Часть этого раствора через смолоотделитель 3 подается в сборник 11 маточного раствора, циркулирующего через нижнюю часть скруббера с помощью насоса 12. Сюда же поступает маточный раствор с центрифуги 8.

Из нижней зоны скруббера часть раствора, в котором содержится около 1 % свободной серной кислоты и 40 % сульфата аммония, отбирается через смолоотделитель 3 в сборник 10 и насосом 9 подается в вакуум-выпарной аппарат 6. Образовавшиеся здесь кристаллы опускаются в нижнюю коническую часть аппарата, выполняющую роль кристаллорастителя, где мелкие кристаллы поддерживаются во взвешенном состоянии в восходящем потоке свежего раствора. Это обеспечивает их рост при небольшом пересыщении раствора, и более 60 % кристаллов сульфата аммония получаются с размерами, превышающими 0,5 мм. Такие же результаты достигаются при использовании выпарных аппаратов, снабженных выносными кристаллорастителями. Суспензия из выпарного аппарата, содержащая 50-60 % кристаллов, подается для фильтрования на центрифугу 8, где кристаллы промываются горячим конденсатом при температуре 70-80 °С для удаления остатков кислоты. Затем продукт направляется на сушку.

Сульфат аммония, технические — Справочник химика 21

    Комплексный амилолитический ферментный препарат полу- чают путем выращивания плесневых грибов на твердой питательной среде с последующей сушкой и измельчением полученной массы. Более активный препарат фермента получают путем экстракции такого грибного солода с последующим выпариванием и сушкой. Еще более активные ферментные препараты можно выделить из культуральной жидкости путем осаждения амилазы ацетоном и дальнейшим высушиванием коагулята при температуре 27—28°С. Для осаждения фермента часто используют и сульфат аммония. Предварительно культуральную жидкость выпаривают при температуре 40°С до 40%-ного содержания сухих веществ. Коагулят сушат вместе с наполнителем. В Японии для пищевых нужд используют технический препарат амилазы, полученный адсорбцией фермента из культуральной жидкости особо обработанным крахмалом. Затем амилазу вместе с крахмалом лиофилизируют. [c.194]
    Особенности эксплуатации сатураторных схем. Основные технические решения в сульфатных отделениях сложились в 30-40-х годах. Так, для поддержания теплового баланса сатуратора предполагается установка газового подогревателя на случай, если из-за использования серной кислоты пониженной концентрации или при подаче избыточных количеств воды в систему теплоты образования сульфата аммония (1,173 МДж/кг) окажется недостаточно для испарения всей избыточной воды. [c.204]

    Сульфат аммония технический  [c.364]

    В модифицированных лигносульфонатах марки ЛСТ-МЩ1 определяют устойчивость пены. Встряхивание цилиндра с техническими лигносульфонатами проводится с интенсивностью 180 ударов в минуту. Массовую долю азота в модифицированных технических лигносульфонатах марки ЛСТМ-1 и ЛСТМ-2 устанавливают сжиганием навески в колбе Кьельдаля с серной кислотой. Затем смесь обрабатывают пероксидом водорода и продолжают еще сжигать. После окончания сжигания смесь охлаждают, разбавляют и образовавшуюся соль сульфата аммония разрушают гидроксидом натрия. Далее отгоняют аммиак. Содержимое приемной колбы титруют раствором гидроксида натрия. Основные показатели качества лигносульфонатов технических и модифицированных приведены в табл. 11.1. [c.337]

    К этому можно добавить, что еще в 40—50-е годы сулы >ат аммония относился к сравнительно неплохим удобрениям по концентрации и физико-механическим характеристикам. Техническая революция 50-б0-х годов, резкое изменение уровня агротехники и промышленности минеральных удобрений создали принципиально новую ситуацию. Произошли коренные изменения в ассортименте минеральных удобрений. В настоящее время средняя концентрация питательных вешеств в удобрениях составляет около 42 % против 21,2 % азота у сульфата аммония. Основным азотным удобрением является карбамид (45,5% азота). [c.208]

    Сульфат аммония технический очищенный применяется для производства химических реактивов, в пивоваренной промышленности. Неочищенный технический сульфат аммония применяется в качестве удобрения и отличается от технического очищенного сульфата тем, что в нем допускается небольшое содержание хлоридов, мышьяка и нерастворимых в воде примесей. [c.141]

    Сульфат аммония технический очищенный. …………980—1020 [c.168]

    Сульфат аммония технический — мелкий кристаллический порошок. Получают из раствора сульфата аммония, является отходом производства жидкого сернистого ангидрида. [c.21]

    Сульфат аммония технический [c.227]

    Сульфат аммония технический очиш,еи-н ы й—кристаллический порошок белого цвета. Получают путем переработки технического сульфата аммония. [c.183]

    В отличие от любых схем получения сульфата аммония этот процесс отличается простотой технического оформления, полной механизацией и автоматизацией всех стадий производства, отсутствием отходов и выбросов. Получаемый безводный амМиак соответствует по качеству и себестоимости синтетическому аммиаку. [c.192]

    Сульфат аммония (N1 4)2804 — белый кристаллический порошок. Содержит 21% N (в техническом продукте). [c.476]

    Технический сульфат аммония содержит 20% азота. Какому процентному содержанию чистой соли (N1 4)2804 это соответствует  [c.171]

    Сульфат аммония (НН4)2504 — бесцветные кристаллы ромбической формы с плотностью 1,769 г/сж . Технический сульфат аммония имеет серовато-желтоватый оттенок. При нагревании сульфат аммония разлагается с потерей аммиака, превращаясь в кислые соли. Давление ННз над сульфатом аммония равно при 205  [c.447]

    Аммиак коксового газа был единственным техническим источником получения КНз до создания промышленного способа синтеза аммиака. На коксохимических заводах аммиак улавливают преимущественно в виде сульфата аммония (МН )2804 или концентрированной аммиачной воды. Оба эти продукта используются в качестве азотных удобрений. [c.93]

    Много для развития титримефии сделал немецкий химик и фармацевт Ф. Мор, который ввел в объемный анализ различные технические новинки (весы Мора, зажим Мора, бюретка Мора, пипетка Мора и др.), предложил или усовершенствовал целый ряд титриметрических методик (например, известный метод Мора в аргентометрии) и дал им теоретическое обоснование, синтезировал н ввел в практику анализа двойной сульфат аммония и железа(П) — соль Мора (Nh5)2Fe(S04)2 6h30, на1шсал первое систематизированное руководство по титриметрии — Учебник химико-аналитических методов титрования . [c.40]

    Процессы дальнейшего превращения аммиака, выделенного из газовых потоков, в товарные продукты (аммиачная вода, сульфат аммония, диаммонийфосфат и другие аммонийные соли), с достаточной полнотой рассматриваются в руководствах по технической химии и технологии каменноугольных газов [2, 6—9]. [c.229]

    Тиоцианат аммония в значительных количествах получается при очистке коксового газа от циановодородной кислоты. Обычно технический продукт содержит примесь сульфата аммония, который не препятствует использованию тиоцианата аммония в качестве гербицида и десиканта, а также тиосульфата аммония. [c.347]

    Рассмотрена технология перекристаллизации мелкокристаллического сульфата аммония на установке с охладительным кристаллизатором типа Кристалл . Приведены методика расчета кристаллорастителя и техническая характеристика установки различной производительности по соли с размером кристаллов более 1 мм. Ил. 1. Библиогр. список 9 назв. [c.69]

    Навеска 0,8007 г образца технического сульфата аммония обработана 15 мл 30%-го водного раствора формальдегида. Через 10 мин полученный раствор оттитрован 15,25 мл 0,1249 М раствора КОН. Рассчитать содержание (NH,)2SO, в образце. [c.257]

    Расход технического сульфата аммония, содержащего 98,5% (NU,). O  [c.406]

    Таким образом, в ГОСТ 2184 — 77 на Кислоту серную техническую дополнительно следует ввести показатель, ограничивающий содержание 802 Удаление сернистого газа путем продувки воздухом свежих и отработанных кислот от производства нафталина позволит улучшить чистоту маточных растворов и окраску сульфата аммония. [c.23]

    В химически чистом сульфате аммония аммиак составляет 25,76 %, остальные 74,24 % приходятся на долю серной кислоты На отечественных коксохимических заводах для производства сульфата аммония используется серная кислота следующих видов башенная, контактная техническая (привозная и собственных цехов мокрого катализа), отработанная с предприятий органического синтеза, регенерированная после мойки фракций сырого бензола и других коксохимических продуктов Качество серной кислоты нормируется ГОСТом [c.221]

    Для производства сульфата аммония высшего и первого сортов используется контактная серная кислота улучшенной марки Б концентрации 92,5—94,0 % с содержанием железа не более 0,015%, оксидов азота и мышьяка 0,0001 %, для производства сульфата аммония второго сорта используются контактная техническая кислота концентрации 5-92,5 %, содержаш,ая 0,02 % железа, башенная кислота марки А концентрацией 5 75 % и содержанием 0,02 % железа [c.221]

    Испытания проводились с полимерными добавками полиокса марки WSR-301, изготовленного американской фирмой Union arbide и технического полиакриламида, выпускаемого отечественной промышленностью (7% ПАА с MB Ю 13% сульфата аммония). [c.63]

    С целью более полного разделения масляной и водной фаз предложено эмульсию обрабатывать хлористым барием и нейтрализацию вести сульфатом аммония. Хлористый барий желательно вводить в количестве 1.7-1.8%, а сульфат аммо-ния в количестве 0.8-0.9% от веса эмульсии. Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Отработанная эмульсия от станков по трубопровода м направляется в бак емкостью в 5-10 м . По дну бака проведен трубопровод с отверстиями, по которому подается сжатый воздух для перемешивания. При нормальных условиях в бак загружается 17—18% технического хлористого бария от объема эмульсии, который растворяется в водно дисперсионной среде в течение 3-10 мин. При этом масло и эмульгаторы всплывают на поверхность. Затем перемешивание прекращается и разложившаяся Зйульсия отстаивается в течение 30 мин, после чего масло отбирается, а в водный остаток вводится сухой технический сульфат аммония для перевода солей бария в фильтруемое состояние При перемешивании воздухом в объеме 8-9%. Далее смесь пёремешивается еще 10 мин, выпавший осадок отфильтровывается, а чистая водная фаза сбрасывается в канализацию. Очищенная вода содержит не более 7.0-10 мг/л нефтепродуктов. Хлористый барий является самым эффективным деэмульгатором для разложения отработанных эмульсий НГЛ-205 и СДМУ, а также их смесей. [c.204]

    Азотистые основания выделяются из нафташшовой и поглотительной фракций обработкой их 20 — 30 мас.%. раствором серной кислотьг Раствор сульфатов оснований нейтрализуют концентрированной аммиачной водой. Образующийся раствор сульфата аммония возвращается в сульфатный цех, а смесь, содержащая гомологи пиридина, хинолин, изохинолин и их гомологи, подвергается ректификации в вакууме с получением индивидуальных веществ и технических продуктов, используемых при обогащении в качестве флото-реагентов, ингибиторов коррозии. [c.73]

    АЗОТНЫЕ УДОБРЕНИЯ — неорганические и органические вещества, содержащие азот, хорошо растворяются в воде. Их вносят в почву для питания растений (соли) или применяют для поверхностной подкормки опрыскиванием (растворы аммиака, карбамида). Азот в А. у. может содержаться в нескольких формах аммиачной, нитратной, смешанной — аммиачно-нитратной, амидной. Этот признак и лежит в основе классификации А. у. Аммиачные удобрения ламмиачная вода (20—22% Ы), сульфат аммония (21% Н), хлорид аммония (26% Ы) нитратные удобрения 1штрат натрия (16% Н), нитрат калия (14% Ы), нитрат кальция (16% Н) аммиачно-нитратные удобрения нитрат аммония (34% Ы) амидные удобрения цианамид кальция (35% Ы, технический продукт 19—22% Н), мочевина, или карбамид (47% Ы). Наряду с перечисленными А. у. применяются смешанные удобрения, также содержащие азот (ам-мофосы, нитрофоска). [c.11]

    Фосфатно-сульфатно-боратная добавка отличается от фосфатно-сульфат-иой тем, что кроме фосфата и сульфата аммония она содержит также орто-борную кислоту. Эти компоненты вводят в раствор аммиачной селитры в виде водных растворов ортоборной кислоты, чистого диаммонийфосфата и технического сульфата аммония из расчета содержания их в готовом продукте соответственно 0,2% 0,2% и 0,01%. Гранулы аммиачной селитры, содержащие эту добавку, практически не разрушаются от температурных колебаний. Эту добавку, получившую название Пермален , используют за рубежом в сочетании с применением опудривающих добавок. [c.164]

    Водорастворимым марганцевым удобрением является сульфат марганца MnSO -GH O. Технический сульфат марганца для сельского хозяйства содержит 25% Мп. Сульфат марганца образуется при растворении карбонатных марганцевых руд в серной кислоте или при выщелачивании предварительно восстановленной природной руды сульфатом аммония. [c.346]

    Вычислить массовую долю MgSOi 7Н2О в техническом препарате сульфата аммония, если для анализа взяли навеску 0,5117 г и получили осадок Mg2P207 массой 0,0183 г. [c.57]

    Актуальность вопросов сохранения среды обитания, с одной стороны, выживаемость и подъем экономики в условиях конкуренции, с другой стороны, диктуют неизбежность технического перевооружения энергетики на базе технологий комплексного и комбинированного использования угля. За рубежом освоены промышленные технологии, в которых из бурых углей получают син-тез-газ, топливо для котлов, нафту для производства бензина, ксенон и криптон, аммиак, фенол, сульфат аммония, углекислоту. Это прообраз перевооружения угольной промышленности на иной технологической и технической основе. Новое поколение технологий переработки угля связано с вовлечением нетрадици- [c.5]

    Технический пятиоксид ниобия. Растворяют при нагревании 0,25 г пробы в 20 мл концентрированной Н2804 с 3 г сульфата аммоння. По охлаждении добавляют 100 мл 10%-ного раствора винноп кислоты, переводят раствор в мерную колбу вместимостью 250 мл и разбавляют до метки 4 %-ным раствором винной кислоты. Отбирают 10,0 мл этого раствора в мерную колбу вместимостью 50 мл и ведут далее определение, как описано в определении 1. [c.116]

    В зависимости от метода производства технический продукт содержит 70—90 % основного вещества и примеси (вода, аммониевая соль имидодисульфоновой кислоты и сульфат аммония). [c.355]

    Пробы цианидов получали в виде растворов с условной концентрацией 5—40%, в пересчете на КСЫ. Цианистый водород выделяли из паров после производственной амм иачиой колонны. По схеме, принятой при разработке технологии цианоочистки газа, из паров предварительно поглощали аммиак кислым раствором сульфата аммония, затем пары конденсировали, сероводород выделяли из конденсата дистилляцией на колонном аппарате, цианистый водород отдували из кубового остатка инертным газом и поглощали раствором щелочи жидким техническим едким натром (ГОСТ 2263—59) или суспензией химически чистого гидрата окиси кальция. Были приготовлены также пробы цианидов из воды цикла конечного охлаждения газа, путем отдувки цианистого водорода и поглощения его раствором щелочи. [c.87]

    На рис. 9.17,6 изображена схема установки для аммонизации воды сульфатом аммония. Так как этот технический продукт содержит значительное количество нерастворимых примесей, его растворы отстаивают (в течение суток) и перед употреблением фильтруют через 2—3 слоя мешковины или другого фильтрующего материала. Сульфат аммония не вызывает образования отложений карбоната кальция, как и другие некарбонатные соли аммония. Поэтому его целесобразно применять на малых водопроводах при обработке вод с повышенной карбонатной жесткостью. На крупных водопроводных станциях аммонизацию воды обычно осуществляют газообразным аммиаком. [c.790]

    НзЗ, ЫН40Н, Оа Каталити Газойль, Нг Сульфат аммония (I), тиосульфат аммония(11) ческая перерабо сложного Продукты, очищенные от сернистых соединений Соль никеля в аммиачной воде, содержащей НаЗ, 25 бар, 150—160° С, в зависимости от соотношения количеств аммиачной воды и воздуха в исходной смеси получается I или II. Выход 100% [1069] тка технического сырья состава N13 100 бар. NiO (превращается в ходе реакции в NiS) активнее NiS в тех же условиях [2375] Сульфидный никель-вольфрамовый катализатор 60 бар, 377° С, степень удаления серы 99% [880]. См. также [890, 2383, 2384]  [c.924]

Сульфат аммония

Английское название: Ammonium sulfate

Синонимы: Аммоний сернокислый, аммония сульфат, диаммониевая соль серной кислоты;

ГОСТ, CAS, ТУ: CAS 7783-20-2; ТУ 113-03-10-18-91

Формула: (NH₄)₂SO₄

Внешний вид: кристаллы ромбической системы, пл. 1,769 г/см3. Реактив хорошо растворим в воде (43,0% при 20°С), нерастворим в этиловом спирте. При 355°С разлагается на аммиак и кислую соль.

Применение: производство гербицидов; кормов для животных; выделки кож; строительной изоляции.

Характеристики продукта:

 

Сульфат аммония
марки А		Сульфат аммония
марки Б		Сульфат аммония
марки В
Внешний видКристаллы прозрачные или слабоокрашенные
Массовая доля азота в пересчете на сухое вещество, %, не менее212121
Массовая доля воды, %, не более0,30,30,3
Массовая доля свободной серной кислоты, %, не более0,050,050,05
Массовая доля нерастворимых примесей, %,
не более		0.020,040,05
Рассыпчатость, %100100100


Условия хранения: Хранить в холодном сухом месте, в хорошо проветриваемом помещении.

Срок годности: 6 месяцев.

Упаковка: Сульфат аммония (аммоний сернокислый) упаковывают в четырех – шестислойные бумажные мешки или полиэтиленовые мешки. Фасовка: мешки, 25 кг.

Получение 27-30% -ного раствора сульфата аммония из газообразного аммиака и концентрированной серной кислоты для использования при производстве простого суперфосфата

АННОТАЦИЯ

В работе на опытно-промышленной установке получены образцы 27-30%-ного раствора сульфата аммония с получением водного 9-10%-ного раствора аммиака и с последующей нейтрализацией концентрированной серной кислотой с концентрацией не менее 92,5% до рН 7,5-8,0. Изучены состав и свойства полученных образцов. Подобран оптимальный режим работы для опытно-промышленной установки.

ABSTRACT

In a pilot plant, samples of a 27-30% solution of ammonium sulfate were obtained to obtain aqueous 9-10% solution of ammonia and then neutralized with concentrated sulfuric acid with a concentration of at least 92,5% to a pH of 7,5- 8,0. The composition and properties of the obtained samples were studied. The optimal operating mode for the pilot plant was selected.

 

Ключевые слова: сульфат аммония, аммиак, серная кислота, суперфосфат.

Keywords: ammonium sulfate, ammonia, sulfuric acid, superphosphate.

 

Введение. Как известно, сера играет важную роль в жизнедеятельности растений. Достаточно сказать, что сера, как и азот, является обязательной составляющей белков и 90% содержания ее в растениях приходится на белковые соединения [9]. Одним из основных источников серы для растений является сульфат аммония, который производят в основном двумя методами – сатураторным и бессатураторным.

Производство сульфата аммония возникло вначале на газовых, затем на коксогазовых заводах из аммиака, улавливаемого из светильного и коксового газов. Производство сульфата аммония из газов коксовых печей особенно расширилось в связи с мощным развитием металлургической промышленности, требующей больших количеств кокса. После Первой мировой войны для получения сульфата аммония стали в больших количествах применять синтетический аммиак [6].

Предлагаемый метод получения сульфата аммония, в отличие от классических методов, заключается в том, что получают раствор сульфата аммония нейтрализацией 9-10%-ной аммиачной воды, концентрированной (не менее 92,5%) серной кислотой. Полученный водный раствор сульфата аммония имеет концентрацию 27-30%, которую можно использовать для производства суперфосфата.

Производство сложного удобрения на основе простого суперфосфата по классической схеме существует уже более 150 лет фактически в неизменном виде, что не отвечает современным требованиям ни по качеству получаемого продукта, ни по интенсивности его осуществления. Для совершенствования технологии сложных удобрений на базе простого суперфосфата в дальнейших опытах разложение фосфатного сырья осуществляли концентрированной серной кислотой [7]. Одним из эффективных способов интенсификации процесса разложения природных фосфатов серной кислотой является применение интенсифицирующих добавок – сульфата аммония или бисульфата аммония [8]. В процессе переработки природного фосфата смесью серной кислоты и сульфата аммония (бисульфатом аммония) образуется азотно-фосфорное удобрение, так называемый азотированный суперфосфат, содержащий 6-10% N и 10,5-14% усвояемой Р2О5 [11]. В работе авторов [12] велись работы по получению комплексных удобрений, содержащих в своем составе, кроме фосфора, водорастворимую серу в виде (NH4)2SO4 и усвояемого гипса. Из этого следует, что использование или присутствие сульфата аммония в комплексных удобрениях увеличивает эффективность применения данного минерального удобрения.

Опытно-экспериментальная часть. Схема опытно-промышленной установки по получению раствора сульфата аммония показана на рисунке 1.

Рисунок 1. Принципиальная схема опытно-промышленной установки по получению раствора сульфата аммония: 1 – скруббер-аммонизатор; 2 – емкость для серной кислоты; 3 – дозирующий плунжерный насос; 4, 8, 10 – центробежный насос; 5 – емкость для раствора (Nh5)2SO4; 6 – емкость для воды и аспирации; 7 – скруббер для улавливания аммиака; 9 –теплообменник

 

Эксперименты проводили следующим образом. В скруббер-аммонизатор 1 принимается свежая артезианская вода до уровня 50%. Принимается в рубашку скруббера-аммонизатора 1 захоложенная (или охлаждающая) вода и циркулируется по системе охлаждения. Для проверки заполнения рубашки скруббера-аммонизатора 1 захоложенной (или охлаждающей) водой открывается воздушник на рубашке скруббера-аммонизатора 1 и после выпуска воздуха закрывается.

В скруббер-аммонизатор 1 принимается артезианская вода из сборника 6 и с помощью насоса 4 в количестве 3,5÷3,6 m3 до уровня 45÷50% по уровнемеру подается в скруббер-аммонизатор 1. Устанавливается циркуляция воды через циркуляционный насос 4 по линии входа и выхода раствора.

Для получения аммиачной воды в скруббер-аммонизаторе 1 в нижнюю часть медленно подается газообразный аммиак, при этом не допускается превышение температуры получаемого аммиачно-водного раствора выше 40 ºС (TIR 04, TIR 03, TIR 05). При росте температуры жидкости выше 40ºС уменьшается количество подаваемого газообразного аммиака в скруббер-аммонизатор 1 путем прикрытия запорной арматуры на линии подачи газообразного аммиака.

Реакция получения аммиачной воды из газообразного аммиака и воды протекает по следующему уравнению:

При этом выделяется тепло в процессе растворения аммиака в количестве 495 ккал/кг (2070 кдж/кг) [10].

Для улавливания непрореагировавшего газообразного аммиака включается в работу система улавливания газов и паров из скруббера-аммонизатора 1. Непрореагировавший газообразный аммиак выходит из верхней части скруббера-аммонизатора 1 и направляется в аппарат – промыватель выброса газов и паров 7. Очищенный воздух после промывателя выброса газов и паров 7 сбрасывается в атмосферу. Сборник 6 предварительно заполняется водой на 50%, и включается циркуляция воды в системе улавливания: сборник 6 – циркуляционный насос 8 – теплообменник-холодильник 9 – промыватель выброса газов и паров 7. По мере роста концентрации аммиака в промывочном растворе часть его подается в верхнюю часть скруббера – аммонизатора 1 через насос 4 для переработки. Недостаток промывочного раствора компенсируется подпиткой свежей артезианской водой в сборник конденсата газов и паров 6.

Подачу газообразного аммиака прекращают при достижении концентрации аммиака в аммиачной воде 9,0%, которая определяется периодически согласно ГОСТ [2; 3].

Серная кислота (не менее 92,5%) из емкости 2 с помощью дозирующего плунжерного насоса 3 подается на верхнюю часть скруббера – аммонизатора 1 со смешиванием циркуляционной аммиачной воды.

Реакция нейтрализации аммиачной воды серной кислотой протекает по следующему уравнению:

Температура раствора в скруббер-аммонизаторе 1 во время подачи серной кислоты поддерживается не выше 50ºС и регулируется путем увеличения или уменьшения количества подаваемой серной кислоты в скруббер-аммонизатор 1. Продолжительность операции – 4 часа. Суммарный расход серной кислоты будет в пределах 580-650 литров в зависимости от концентрации аммиака в растворе. В процессе нейтрализации аммиачной воды серной кислотой производят периодический отбор проб на анализ концентрации раствора на содержание сульфата аммония и свободного аммиака согласно методикам [10] и ГОСТ [2-5]. Конечная концентрация сульфата аммония в растворе должна быть 27-30%, а рН – 7,5-8,0. После достижения показателей продолжается циркуляция раствора сульфата аммония в течение 15÷20 минут через циркуляционный насос 4 по линии входа и выхода раствора.

По истечении времени циркуляции раствор сульфата аммония перекачивается в сборник для хранения сульфата аммония 5 с объемом V-16 m3 с помощью насоса 4.

С помощью насоса 10 раствор сульфата аммония подается потребителю.

Результаты приведены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1.

Концентрация аммиака при получении аммиачной воды

№

Время, час

Концентрация аммиака, %

Температура процесса, 0С

1

1

3,2

32

2

2

6,1

35

3

3

9,5

32

 

Таблица 2.

Концентрация аммиака и сульфата аммония при получениираствора сульфата аммония

№

Время, час

Концентрация аммиака, %

Концентрация

сульфата аммония, %

Температура процесса, 0С

рН

1

1

7,65

5,6

42

  

2

2

5,15

13,1

42

  

3

3

2,79

20,2

45

  

4

4

0,3

27,2

45

8,2

 

Результаты и их обсуждение. Из таблицы 1 видно, что для получения 9,5%-ного водного раствора аммиака необходимо 3 часа. Из-за подачи охлаждающей воды в рубашку скруббера-аммонизатора 1 температура процесса поддерживалась в среднем 33оС.

В таблице 2 приведены данные о снижении концентрации аммиака в растворе с добавлением серной кислоты и ростом концентрации сульфата аммония. Здесь также из-за подачи охлаждающей воды в рубашку скруббера-аммонизатора 1 температура процесса поддерживалась в среднем 43,5оС. Продолжительность процесса – 4 часа.

Заключение. Таким образом, путем получения 9,5% аммиачной воды и ее дальнейшей нейтрализацией концентрированной (не менее 92,5) серной кислотой был получен 27,2% раствор сульфата аммония, который можно использовать в производстве суперфосфата.

 

Список литературы:
1. Аналитический контроль производства в азотной промышленности. – Вып. 16. Анализ продуктов в цехе капролактама. – М.: Химия, 1968. – 80 с.
2. ГОСТ 9-92 Аммиак водный технический. Технические условия // База ГОСТов [Электронный ресурс] – Режим доступа: https://allgosts.ru/71/060/gost_9-92 (дата обращения: 12.11.2019).
3. ГОСТ 29237-91 (ИСО 7108-85) Раствор аммиака технический. Определение содержания аммиака. Титриметрический метод // База ГОСТов [Электронный ресурс] – Режим доступа: https://allgosts.ru/71/060/gost_29237-91 (дата обращения: 12.11.2019).
4. ГОСТ 30181.1-94 Удобрения минеральные. Метод определения суммарной массовой доли азота в сложных удобрениях (в аммонийной и амидной формах с отгонкой аммиака) // База ГОСТов [Электронный ресурс] – Режим доступа: https://allgosts.ru/65/080/gost_30181.1-94 (дата обращения: 12.11.2019).
5. ГОСТ 30181.9-94 Удобрения минеральные. Метод определения массовой доли общего азота в сложных удобрениях (дистилляционный метод с восстановлением нитратного азота хромом и минерализацией органического азота) // База ГОСТов [Электронный ресурс] – Режим доступа: https://allgosts.ru/65/080/gost_30181.9-94 (дата обращения: 12.11.2019).
6. Еримбет Н., Арыстанбаев К.Е. Автоматизация процесса получения сульфата аммония бессатураторным методом / Н. Еримбет, К.Е. Арыстанбаев, Южно-Казахстанский гос. ун-т им. М. Ауезова // Молодой ученый. – 2016. – № 4 (108). С. 33-37.
7. Интенсивная технология получения PK-удобрения / Р.М. Назирова, С.М. Таджиев, С.Р. Мирсалимова, Ш.Ш. Акрамов, Ферганский политехн. ин-т, ИОНХ АНРУз // Современные научные исследования и разработки. – 2018. – № 3 (20). – С. 415-418.
8. Самедов М.М., Оруджев С.С., Самедова Т.А. Интенсификация и математическое описание процесса производства суперфосфата // Химическая промышленность сегодня. – 2005. – № 8. – С. 19.
9. Содержание серы в почвах Ульяновской области. Урожайность яровой пшеницы и баланс элементов питания в черноземе, выщелоченном при применении серосодержащих удобрений / Д.А. Захарова, В.С. Смывалов, А.Х. Куликова, Е.А. Черкасов // International agricultural journal. – 2019. – № 3 (369). – С. 50-54.
10. Соколовский А.А., Яшке Е.В. Технология минеральных удобрений и кислот. – М.: Химия, 1971. – 456 с.
11. Технология минеральных солей (удобрений, пестицидов, промышленных солей, окислов и кислот). – 4-е изд., испр. / М.Е. Позин и др. – Л.: Химия, 1974. – Ч. II. – С. 768.
12. Физико-химические и товарные свойства сложных азот-фосфор-сера-кальцийсодержащих удобрений / С.С. Ортикова, У.К. Алимов, О.А. Бадалова, Ш.С. Намазов // Химическая промышленность сегодня. – 2017. – № 5. – С. 25-29.

 

Сульфат аммония меш.40кг.очищенный ГОСТ

 Сульфат аммония меш.40кг. очищенный ГОСТ
Цена 55, 35 руб/кг

Заказать

Как оформить заявку

Доставка

Связаться с нами

Сульфат аммония (Nh5)2SO4 – бесцветные кристаллы, плотность – 1,766 г/см3. При температуре выше +100°C разлагается с выделением аммиака Nh4и образованием сначала Nh5HSO4, а впоследствии (Nh5)2S2O7 и сульфаниловой кислоты.

Растворимость в воде: при 0°C – 70,5 г/100 г, при +25°C – 76,4 г/100 г, при +100°C – 101,7 г/100 г. Окисляется до N2 под действием сильных окислителей, например, марганцевокислого калия KMnO4.

Сульфат аммония содержит:

  • азота по массовой доле в пересчете на сухое вещество – не менее 21 %;

  • воды – 0,2 %;

  • серной кислоты – не более 0,03 %.

Фракционный состав удобрения:

  • массовая доля фракции размером более 0,5 мм – не менее 80 %;

  • менее 6 мм – 100 %.

Рассыпчатость – 100 %.

Массовая доля остатка, не растворимого в воде, не превышает 0,02 %.

Применение

Сельское хозяйство

Сульфат аммония в сельском хозяйстве используют как основное удобрение под различные культуры.

Промышленность

Сульфат аммония в химической промышленности используют как компонент осадительной ванны при формировании вискозного волокна. В стекольной промышленности – в качестве добавки к стекольной шихте для улучшения ее плавкости.

Осаждение белков сульфатом аммония: ключ к высаливанию

Осаждение соли может быть очень мощным инструментом для очистки белков путем осаждения. Сульфат аммония обычно является предпочтительной солью, поскольку он дешев, хорошо растворяется в воде и может стать намного более гидратированным (взаимодействует с большим количеством молекул воды), чем почти любой другой ионный растворитель. На практике сульфат аммония добавляют либо непосредственно в виде твердого вещества, либо в виде (обычно) насыщенного раствора для осаждения желаемых белков.

При низких концентрациях соли (<0,15M) добавление большего количества соли в целом имеет тенденцию к увеличению растворимости белков, поскольку ионы защищают молекулы белка от зарядов других молекул; эта тенденция называется «засаливанием». В какой-то момент ионная сила становится слишком высокой и начинает оказывать негативное влияние на растворимость белков, называемое «высаливанием». Это происходит потому, что растворенная соль конкурирует с белками за скудные молекулы воды, увеличивая поверхностное натяжение воды и, следовательно, заставляя белок более плотно складываться.Уменьшение площади поверхности белка означает меньшее количество взаимодействий белок-вода, что обеспечивает более гидрофобные взаимодействия между молекулами белка, вызывая агрегацию и последующее осаждение.

Белки в растворе также можно фракционировать, поскольку они будут выпадать в осадок в зависимости от концентрации соли. Таким образом, можно очищать определенные белки, добавляя определенное количество сульфата аммония для осаждения нежелательных белков, извлекая супернатант, а затем добавляя немного больше сульфата аммония для осаждения желаемого белка, а затем сохраняя этот осадок. осажденный белок.Поскольку осаждение соли влияет только на растворимость белков и не денатурирует их, выделенная фракция может храниться в растворе соли в течение длительных периодов времени, не беспокоясь о бактериальном загрязнении, поскольку высокое содержание соли подавляет любой рост микробов или протеазную активность.

Поскольку осаждение сульфатом аммония только снижает растворимость белков и не денатурирует их, белки могут быть сконцентрированы путем удаления оставшегося раствора сульфата аммония, тогда осадок белка можно реолюбилизировать в стандартных буферах или при более низкой концентрации сульфата аммония.Затем можно использовать хроматографию гидрофобного взаимодействия или гель-фильтрационную хроматографию для дальнейшей очистки белкового раствора. Сульфат аммония также можно использовать для возврата некоторых белков, развёрнутых денатурантами, такими как мочевина, к их правильной нативной конформации путем постепенного увеличения концентрации сульфата аммония.

Есть несколько передовых методов, которые следует учитывать при работе с сульфатом аммония, например:

  • Используйте ступку и пестик, чтобы разбить комки, или измельчите сульфат аммония, чтобы облегчить добавление и растворение.
  • Добавляйте за раз только небольшое количество сульфата аммония, подождите, пока он растворится, и осторожно перемешайте, чтобы избежать пенообразования.
  • Используйте буфер, такой как 50 мМ HEPES или Tris, чтобы минимизировать подкисляющую природу сульфата аммония.
  • Используйте сульфат аммония аналитической чистоты, так как низшие сорта обычно содержат загрязнение тяжелыми металлами.

Процесс осаждения солей имеет некоторые недостатки. Высаливание белков требует предварительных знаний о растворимости белка.Кроме того, любые загрязнители, присутствующие в исходном образце, могут все еще присутствовать во фракции, содержащей интересующий белок; этот процесс концентрирует белок, но не очищает его. Кроме того, может потребоваться удалить соль из образца белка, и поэтому потребуется дальнейшая обработка в форме диализа или хроматографии.

Связанные сообщения в блоге

Протокол осаждения сульфата аммония — Exalpha Biologicals inc.

Описание

Осаждение сульфатом аммония — один из наиболее часто используемых методов очистки белка из раствора.В растворе белки образуют водородные связи с молекулами воды через свои открытые полярные и ионные группы. Когда добавляются высокие концентрации небольших, сильно заряженных ионов, таких как сульфат аммония, эти группы конкурируют с белками за связывание с молекулами воды. Это удаляет молекулы воды из белка и снижает его растворимость, что приводит к осаждению. Критические факторы, которые влияют на концентрацию, при которой будет осаждаться конкретный белок, включают: количество и положение полярных групп, молекулярную массу белка, pH раствора и температуру, при которой выполняется осаждение.Концентрация, при которой осаждаются антитела, варьируется у разных видов; большинство кроличьих антител преципитируют 40% -ным насыщенным раствором, тогда как мышиные антитела требуют 45-50% -ного насыщения.

Протокол

  1. Дайте сыворотке или асцитической жидкости оттаять, определите общий объем и центрифугируйте при 3000 g в течение 30 минут.
  2. Перенесите образец в стакан, содержащий стержень для перемешивания, и поместите на магнитную мешалку.
  3. Пока образец перемешивается, медленно добавляют насыщенный сульфат аммония, чтобы довести конечную концентрацию до 50% насыщения.
    1. Необходимый объем сульфата аммония равен объему пробы.
    2. Очень медленное добавление сульфата аммония гарантирует, что локальная концентрация вокруг места добавления не превышает желаемой концентрации соли.
  4. После добавления общего объема сульфата аммония переместите химический стакан на 4 ° C на 6 часов или на ночь.
  5. Перенести в коническую пробирку и центрифугировать осадок при 3000 g в течение 30 минут.
  6. Осторожно удалите и выбросьте супернатант. Переверните коническую трубку и дренажный колодец. Для сыворотки или асцита ресуспендируйте осадок в 30-50% от начального объема в 1XPBS. Для супернатантов культуры ткани моноклональных антител ресуспендируют осадок в 10% от начального объема в 1X PBS.
  7. Перенесите раствор антител в диализную трубку и проведите диализ по сравнению с тремя заменами 1XPBS / 0,08% азида натрия. Обязательно оставьте достаточно места для расширения раствора антител во время диализа.Обычно достаточно удвоенного объема ресуспендирования.
  8. Удалите раствор антител из трубки и центрифуги, чтобы удалить оставшийся мусор.
  9. Определите концентрацию и храните при -80 ° C для длительного хранения.

Очистка трансформирующего белок-полимерного конъюгата путем настройки растворимости белка

Материалы

Лизоцим (Lyz) из куриного яичного белка, α-химотрипсин (CT) из поджелудочной железы крупного рогатого скота, глицин, хлорид меди (II) (Cu (II) Cl), аскорбат натрия (NaAsc), 1,1,4,7,10,10-гексаметилтриэтилентетрамин (HMTETA) и метакрилат метилового эфира полиэтиленгликоля (OEGMA 500 ) были приобретены у Sigma-Aldrich (St.Луис, Миссури). 3 — [[2- (Метакрилоилокси) этил] диметиламмонио] пропионат (CBMA) был приобретен у TCI America. HMTETA очищали с использованием колонки с основным оксидом алюминия. Набор для окрашивания серебра Pierce был приобретен у ThermoFisher. Гели SDS-PAGE (4-15% готовые гели Mini-PROTEAN TGX) были приобретены у Bio-Rad. Все остальные химические вещества использовались без дополнительной очистки и были приобретены у Sigma Aldrich, если не указано иное. Положительно заряженный инициатор ATRP получали, как описано ранее 13 .Трубки для диализа для очистки были приобретены у Spectra / Por, Spectrum Laboratories Inc., Калифорния.

Приборы

Ультрафиолетовая-видимая (УФ-видимая) спектрофотометрия (Lambda 45, PerkinElmer) использовалась для определения концентраций белка с помощью анализов бицинхониновой кислоты (BCA). Среднее числовое значение ( M n ), среднее значение веса ( M w ) и дисперсность ( ) полимеров (расщепленных и свободных) определяли с помощью гель-проникающей хроматографии (GPC) (Waters 2695 Series). с процессором данных, тремя колонками (Waters Ultrahydrogel Linier, 250 и 500) и детектором показателя преломления с использованием рабочего буфера фосфатно-солевого буфера Дульбекко с 0.02 мас.% Азида натрия при скорости потока 1,0 мл / мин. Калибровку проводили с использованием стандартов Pullulan (Служба стандартов полимеров, Амхерст, Массачусетс). Данные времяпролетной масс-спектрометрии с матричной десорбцией / ионизацией (MALDI-ToF MS) были получены на спектрометре Perseptive Biosystems Voyager, Elite MALDI-ToF, расположенном в Центре молекулярного анализа Университета Карнеги-Меллона. Гидродинамические диаметры динамического рассеяния света (DLS) измеряли на приборе Malvern Zetasizer nano-ZS, расположенном на химическом факультете Университета Карнеги-Меллона.Анализ осаждения сульфата аммония и ферментативную активность измеряли на многорежимном считывающем устройстве Synergy h2 (BioTek Instruments, Winooski, VT).

Модификации инициатора ATRP (1, 3, 5) на Lyz

Для синтеза Lyz в среднем с одной модификацией инициатора (Lyz (1+)), 100 мг (0,007 ммоль Lyz, 0,049 ммоль NH 2 ) нативного Lyz растворяли в 20 мл 0,1 М натрий-фосфатного буфера, pH 8. 25 мг положительно заряженного инициатора ATRP (0,049 ммоль, 1 эквивалент против числа групп NH 2 ) растворяли в 100 мкл ДМСО.Растворенный инициатор добавляли к раствору Lyz и перемешивали при 4 ° C в течение 2 часов. Затем Lyz-инициатор очищали диализом (MWCO 8 кДа) против деионизированной воды при 4 ° C и затем лиофилизировали.

Для синтеза Lyz в среднем с 3 модификациями инициатора (Lyz (3+)) 150 мг (0,01 ммоль Lyz, 0,073 ммоль NH 2 ) нативного Lyz растворяли в 29 мл 0,1 М натрий-фосфатного буфера, pH 8. 114 мг (0,221 ммоль, 3 эквивалента по отношению к количеству групп NH 2 ) положительно заряженного инициатора, растворенного в 1 мл ДМСО, добавляли к раствору Lyz и перемешивали в течение 2 ч при 4 ° C.Lyz, модифицированный инициатором, очищали диализом, как описано выше, и затем лиофилизировали.

Для синтеза Lyz в среднем с 5 модификациями инициатора (Lyz (5+)) 500 мг (0,035 ммоль Lyz, 0,245 ммоль NH 2 ) Lyz растворяли в 100 мл 0,1 М натрий-фосфатного буфера, pH 8. 631 мг положительно заряженного инициатора (1,22 ммоль, 5 эквивалентов по отношению к количеству групп NH 2 ) растворяли в 1 мл ДМСО и затем добавляли к раствору Lyz. Реакционный раствор перемешивали при 4 ° C в течение 2 часов.Lyz, модифицированный инициатором, очищали диализом, как описано выше, и затем лиофилизировали.

MALDI-ToF

Модифицированный инициатором Lyz (1 мг / мл) или нативный Lyz (1 мг / мл) смешивали с матрицей MALDI (10 мг синапиновой кислоты, 250 мкл 0,1% трифторуксусной кислоты и 250 мкл 50% ацетонитрила. ) в соотношении 1: 1. Два микролитра смешанного образца загружали в мишень MALDI из стерлингового серебра. Измерения MALDI-TOF MS были записаны с использованием Perseptive Voyager STR MS с азотным лазером (337 нм) и ускоряющим напряжением 20 кВ при напряжении сетки 90%.Всего для каждого спектра было накоплено 500 лазерных выстрелов, покрывающих все пятно. Цитохром С, апомиоглобин и альдолаза использовали в качестве калибровочных образцов. Среднее количество инициатора, присоединенного к Lyz, определяли путем взятия разницы в значениях пиков m / z между нативными Lyz и Lyz-инициаторами и деления на массу прореагировавшего инициатора (без группы NHS) (321 Да).

ATRP от Lyz-инициатора

20 мг Lyz (1+) (1,4 мкмоль группы инициаторов ATRP) и 7,8 мг CBMA для целевого DP 25, 62 мг CBMA для целевого DP 200, 17 мг OEGMA для целевого DP 25 и 136 мг OEGMA для целевой DP 200 растворяли в 1120 мкл 0.1 М фосфат натрия, pH 8. Растворы Lyz (1+) и мономера барботировали в атмосфере аргона в течение ~ 7 мин. Одновременно 336 мкл 50 мМ Cu (II) Cl в деионизированной воде барботировали под аргоном в отдельной колбе в течение 2 мин. Затем к раствору Cu (II) Cl добавляли 16,8 мкл 100 мМ аскорбата натрия. После этого 5,3 мкл HMTETA добавляли к восстановленной Cu (II) до Cu (I), и раствор барботировали в течение дополнительной минуты. Затем 280 мкл раствора Cu / лиганд добавляли к раствору Lyz-инициатора / мономера с помощью шприца и запечатанный раствор перемешивали в течение 1 часа.Реакцию останавливали воздействием воздуха, а затем конъюгаты очищали диализом (8 кДа MWCO) против деионизированной воды в течение 24 часов и затем лиофилизировали.

30 мг Lyz (3+) (6,4 мкмоль инициаторных групп) растворяли в 5760 мкл 0,1 М фосфата натрия, pH 8. 37 мг CBMA или 81 мг OEGMA (целевой DP 25) и 295 мг CBMA или 644 мг OEGMA. (целевой DP 200) добавляли к Lyz (3+) и барботировали в течение 15 мин в атмосфере аргона. В отдельной колбе 768 мкл 100 мМ раствора Cu (II) Cl барботировали в атмосфере аргона в течение 2 мин.Затем 77 мкл 100 мМ раствора аскорбата натрия добавляли к барботирующему раствору Cu (II) Cl. Затем 25 мкл лиганда HMTETA добавляли к восстановленной Cu (II) до Cu (I), и раствор барботировали в течение дополнительной минуты. Затем 640 мкл раствора Cu / лиганд переносили с помощью шприца в раствор Lyz-инициатора / мономера. Полимеризацию останавливали выдержкой на воздухе после 1 ч перемешивания. Конъюгаты очищали диализом (8 кДа MWCO) против деионизированной воды в течение 24 часов и затем лиофилизировали.

Всего 30 мг (9,5 мкмоль инициаторных групп) Lyz (5+) растворяли в 18 мл 0,1 М фосфата натрия, pH 8. 54 мг, 109 мг, 217 мг, 326 мг и 434 мг CBMA ( для целевого DP 25, 50, 100, 150 и 200 соответственно) добавляли к Lyz (5+) и барботировали в атмосфере аргона в течение 45 мин. В отдельной колбе барботировали 2,4 мл 50 мМ раствора Cu (II) Cl в течение 10 мин. Затем добавляли 114 мкл 100 мМ аскорбата натрия для восстановления Cu (II) до Cu (I), а затем добавляли 37 мкл лиганда HMTETA. После этого 2 мл раствора Cu / лиганд добавляли к раствору Lyz-инициатора / CBMA.Реакцию останавливали после выдержки на воздухе через 1 час для перемешивания и конъюгаты Lyz (5+) pCBMA очищали диализом (8 кДа MWCO) против деионизированной воды в течение 24 часов и затем лиофилизировали.

32 мг (группы инициаторов 10 мкмоль) Lyz (5+) и 126 мг, 252 мг, 505 мг, 758 мг и 1010 мг OEGMA (для целевого DP 25, 50, 100, 150 и 200 соответственно) растворяли в 9 мл 0,1 М фосфата натрия, pH 8. Раствор Lyz (5 +) / мономер барботировали в течение 30 мин в атмосфере аргона.В отдельной колбе барботировали 1,2 мл 100 мМ раствора Cu (II) Cl в течение 10 мин. Затем добавляли 120 мкл 100 мМ аскорбата натрия для восстановления Cu (II) до Cu (I), а затем добавляли 39 мкл лиганда HMTETA. Затем к раствору Lyz (5 +) / OEGMA добавляли 1 мл раствора Cu / лиганд. Реакцию останавливали после воздействия воздуха через 1 час или перемешивания и конъюгаты Lyz (5+) pOEGMA очищали диализом (8 кДа MWCO) против деионизированной воды в течение 24 часов и затем лиофилизировали.

Свободный синтез полимеров

4.7 мг (конечная концентрация 0,92 мМ) нейтрального инициатора (синтезированного, как описано ранее 41 ) и 442 мг CBMA (целевой DP 100) или 894 мкл OEGMA (целевой DP 100) растворяли в 20 мл деионизированной воды и барботировали под аргон в течение 30 мин. В отдельной колбе барботировали 78 мг Cu (II) Cl в 3 мл деионизированной воды в атмосфере аргона. Затем добавляли 573 мкл раствора аскорбата натрия с концентрацией 20 мг / мл для восстановления Cu (II) до Cu (I), и раствор барботировали в течение 5 минут перед добавлением 186 мкл HMTETA с последующим дополнительным барботированием в течение 1 минуты.Затем 1 мл раствора Cu / лиганд переносили в раствор инициатора / мономера с помощью шприца и герметично закрываемую колбу перемешивали в течение 1 ч при 25 ° C. Конечные концентрации в реакции ATRP составляли 92 мМ мономера, 0,92 мМ инициатора, 9,2 мМ Cu (II) (восстановленный), 11 мМ HMTETA и 0,92 мМ NaAsc. Полимеризацию останавливали выдержкой на воздухе, и полимеры очищали диализом (MWCO 1 кДа) против деионизированной воды в течение 24 часов при 25 ° C. Затем очищенные полимеры лиофилизировали и анализировали с помощью ГПХ на молекулярные массы и дисперсность.

Анализ BCA для определения концентрации белка

Для определения содержания белка в конъюгатах в деионизированной воде готовили 1–3 мг / мл Lyz-полимерных образцов. Затем 25 мкл образца смешивали с 1 мл раствора BCA (50: 1 объем: объем BCA и Cu (II) SO 4 ) и инкубировали при 60 ° C в течение 15 минут. Поглощение регистрировали при 562 нм. Концентрацию белка определяли по стандартной кривой нативного Lyz (0,8-0,012 мг / мл) в деионизированной воде. Молекулярные массы и степень полимеризации Lyz-полимерных конъюгатов оценивали, как описано ранее 41 .

Динамическое рассеяние света для определения размера конъюгата в PBS

Гидродинамические диаметры образцов Lyz определяли на Malvern Zetasizer nano-ZS. Образцы Lyz (нативный, модифицированный инициатором и модифицированный полимер) растворяли в концентрации 1 мг / мл в 0,1 М натрий-фосфатном буфере, pH 8. Образцы фильтровали с использованием шприцевого фильтра из ацетата целлюлозы 0,45 мкМ и измеряли три раза (15 циклов на измерение). . Приведенные значения представляют собой числовое распределение гидродинамических диаметров.

Кислотный гидролиз и GPC

Всего 10–15 мг конъюгатов Lyz – полимер растворяли в пробирках для гидролиза с использованием 6 н. HCl (5 мл).После трех повторений циклов замораживание-насос-оттаивание образцы помещали в масляную баню при 110 ° C под вакуумом на 20 часов. Расщепленные полимеры очищали диализом (MWCO 1 кДа) против деионизированной воды и затем лиофилизировали. Расщепленные полимеры анализировали с помощью ГПХ на молекулярные массы и дисперсность с использованием стандартов пуллулана, как описано ранее.

Осаждение сульфатом аммония

Нативный белок, белки-инициаторы и белковые полимеры растворяли при концентрации белка 2 мг / мл (начальный объем составлял 1 мл) в 50 мМ буфере NaPhos, pH 7.Начальные концентрации белка в образцах измеряли по оптической плотности 280 нм с использованием планшет-ридера Synergy h2. Значения абсорбции были преобразованы в концентрации на основе стандартной кривой нативного белка (от 0 до 2 мг / мл). К растворам добавляли твердые количества сульфата аммония для достижения желаемого процента насыщения, рассчитанного с помощью онлайн-калькулятора EnCor Biotechnology при 25 ° C (http://www.encorbio.com/protocols/AM-SO4.htm). После каждого добавления сульфата аммония образцы встряхивали для обеспечения полного растворения сульфата аммония.Затем образцы оставляли на столе в течение 15 минут с последующим центрифугированием при 16 800 × g в течение 20 минут для осаждения любого осажденного белка. Концентрацию белка в супернатанте измеряли в трех экземплярах по оптической плотности при 280 нм. Супернатант, использованный для определения концентрации белка, снова помещали в образец и добавляли следующую твердую массу сульфата аммония. Процесс смешивания, сидения, центрифугирования и измерения концентрации белка повторяли после каждого добавления сульфата аммония до 100% насыщения (4.1 м) была достигнута. Добавление сульфата аммония увеличивало объем раствора до 1,42 мл при 100% насыщении.

Сульфат аммония также выполняли для нативного белка в присутствии свободных pCBMA или pOEGMA. В этом случае нативный Lyz растворяли в концентрации 2 мг / мл (начальный объем 1 мл) в 50 мМ NaPhos-буфере, pH 7. Добавляли лиофилизированный pCBMA или pOEGMA для соответствия количеству (по массе), как было оценено по результатам BCA. полимера, присутствующего во время эксперимента по осаждению Lyz (5+) pCBMA DP 91 и Lyz (5+) pOEGMA DP 164.Затем осуществляли процесс осаждения сульфата аммония, как описано ранее.

Динамическое рассеяние света для определения размера в сульфате аммония

Нативный белок, белки-инициаторы и белковые полимеры растворяли при концентрации белка 1 мг / мл (начальный объем был 1 мл) в 50 мМ NaPhos-буфере, pH 7. Растворы были фильтровали с использованием шприцевого фильтра из ацетата целлюлозы 0,45 мкМ. Процесс, используемый для осаждения сульфатом аммония, как описано выше, повторяли, но вместо измерения концентрации белка в супернатанте гидродинамические диаметры измеряли в трех повторностях (15 циклов на измерение).Гидродинамические диаметры измеряли при увеличении концентрации сульфата аммония до достижения 100% насыщения. Изменения показателя преломления раствора 61 , диэлектрической проницаемости 62 и вязкости 63 с увеличением соли не повлияли на выходной гидродинамический диаметр.

Динамическое рассеяние света для измерения стабильности размера

Lyz (5+) pCBMA DP 14 и DP 91 растворяли в концентрации 1 мг / мл в 50 мМ NaPhos буфере, pH 7. Добавляли 0,77 мг твердого сульфата аммония и растворяли для достижения 100% насыщенность.Образцы фильтровали с использованием шприцевого фильтра из ацетата целлюлозы 0,45 мкМ. Сразу после фильтрации гидродинамические диаметры измеряли в течение 6 часов, затем снова через 1 неделю, 2 недели и 2,5 месяца. Распределение количества и объема регистрировали после 15 сканирований на одно измерение.

Динамическое рассеяние света для измерения обратимости размера

Lyz (5+) pCBMA DP 91 растворяли в 100% насыщенном сульфате аммония при концентрации 1 мг / мл и измеряли гидродинамический диаметр. Затем образец разбавляли до 50% насыщения (0.5 мг / мл) и 25% насыщения (0,25 мг / мл) и гидродинамические диаметры измеряли после каждого разведения, как описано ранее. Обратимость размеров была также проверена циклическим переключением между 50% и 100% насыщением. Lyz (5+) pCBMA DP 91 растворяли в 50% насыщенном сульфате аммония в концентрации 1 мг / мл. Измеряли гидродинамический диаметр, а затем добавляли твердый сульфат аммония для достижения 100% насыщения, после чего следовало еще одно измерение гидродинамического диаметра. Затем раствор снова разбавляли до 50% насыщения (0.5 мг / мл), измеренного с помощью DLS, затем добавляли сульфат аммония, чтобы снова достичь 100% насыщения. Этот процесс был повторен еще раз, всего 3 полных цикла. Гидродинамические диаметры измеряли, как описано ранее.

Атомистическое моделирование методом МД

Кристаллографическая структура Lyz (ID PDB: 1AKI) была использована для построения структуры нативного белка. Код восстановления в Ambertools 64 использовался для определения состояний протонирования аминокислот. Структуры свободной pCBMA (DP 18) и свободной pOEGMA (DP 25) были сгенерированы с использованием программного пакета PySimm 65 с использованием силового поля, поддерживаемого линейным самоуничтожающимся случайным блужданием.Структура инициатора представляла собой положительно заряженный инициатор ATRP, экспериментально использованный в этом исследовании. Инициаторно-полимерные структуры были присоединены к атомам NZ Lyz в пяти местах: K1, K13, K33, K97, K116, которые были определены из предсказания, основанного на правилах 56 . Lyz моделировали с использованием силового поля CHARMM C36m, а инициаторы / полимеры моделировали с использованием аналоговых параметров из CGenFF 66,67,68 . Файлы топологии были сгенерированы с помощью инструмента psfgen в программном обеспечении VMD 69 .Модель воды TIP3P, реализованная в NAMD, использовалась для сольватации с буферным расстоянием 14 Å. Система нейтрализована добавлением противоионов Na + и Cl — . Дополнительно добавляли NaCl при возрастающих молярных концентрациях (0,0, 0,15, 0,3, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0 и 5,0). CUDA-ускоренный namd 2.13 (ref. 70 ) использовался для выполнения атомистического МД-моделирования, которое было доступно в высокопроизводительном кластере hipergator2 в Университете Флориды.

Конъюгаты подвергали минимизации градиента энергии за 10 000 шагов при ограничении белка. Системы были дополнительно минимизированы на дополнительные 10 000 шагов без ограничений. Затем конъюгаты нагревали до 310,15 К с интервалами 20 пс и приращениями 50 К с использованием ансамбля NVT с последующим 500 пс дополнительного моделирования. После этого ансамбль NPT был применен к каждой системе при давлении 1 бар с отсечкой без сцепления 12 Å и силовым переключением при 10 Å. Для дальнодействующих электростатических взаимодействий использовалось суммирование Эвальда по сетке частиц.Длина связи с участием атомов водорода была ограничена с использованием временного шага 2 фс с помощью алгоритма SETTLE. Моделирование проводилось в течение 500 нс для pCBMA и 200 нс для pOEGMA, а анализ проводился с использованием собственных скриптов VMD tcl. В целом, 200 нс было достаточно времени моделирования, чтобы увидеть коллапс pOEGMA в течение относительно длительного времени.

Анализ ферментативной активности

Ферментативную активность нативных Lyz, Lyz-инициаторов и конъюгатов Lyz-pCBMA измеряли с использованием 4-метилумбеллиферил β-DN, N ‘, N’ ‘- триацетилхитотриозида, низкомолекулярного флуоресцентного субстрата ( λ ex = 360 нм, λ em = 455 нм).Растворы Lyz были приготовлены с концентрацией 1 мг / мл (концентрация Lyz) в 50 мМ NaPhos, pH 6,0. Субстрат растворяли в ДМСО в концентрации 5 мг / мл (6,4 мМ). Чтобы начать реакцию, добавляли 29 мкл растворов Lyz 1 мг / мл (конечная концентрация 2 мкМ) с 8 мкл раствора субстрата (конечная концентрация 50 мкМ) и 963 мл либо 50 мМ NaPhos (pH 6,0), либо 100%. насыщенный сульфат аммония. Реакции инкубировали при 37 ° C на водяной бане. В моменты увеличения времени в течение 4 ч 50 мкл реакционной смеси смешивали со 150 мкл стоп-буфера (100 мМ глицин-NaOH, pH 11) в 96-луночном планшете.Затем измеряли интенсивности флуоресценции (относительные единицы флуоресценции: RFU) в трех экземплярах. Скорости реакции корректировали по холостым пробам субстрата (8 мкл) либо в NaPhos, pH 6,0, либо в 100% насыщенном сульфате аммония (992 мкл). Графики зависимости RFU от времени реакции соответствовали линейной регрессии в GraphPad.

Очистка и гель-анализ SDS-PAGE (pCBMA и pOEGMA)

Нативные Lyz и Lyz (5+) pOEGMA и Lyz (5+) pCBMA DP 91 получали в концентрации 1 мг / мл в деионизированной воде. Нативный Lyz и конъюгаты смешивали в объемном соотношении 1:99 (10 мкл природного Lyz и 990 мкл конъюгата).Добавляли твердый сульфат аммония для достижения 100% насыщения для pCBMA (0,77 г) или 40% насыщения для pOEGMA (0,25 г). Смеси оставляли на 1 час на столе с последующим центрифугированием при 16 800 × g в течение 1 часа. Супернатанты отсасывали и осадки повторно растворяли в 1 мл деионизированной воды. Супернатанты и осадки диализовали в деионизированной воде для удаления сульфата аммония в течение 24 ч при 4 ° C. Ультрафильтрацию (3 кДа MWCO) проводили на диализованных образцах, чтобы сконцентрировать их обратно до исходных концентраций.Анализ SDS-PAGE выполняли на нативном Lyz, Lyz (5+) pCBMA DP 91, Lyz (5+) pOEGMA DP 164, супернатантах, осадках, исходной смеси (до добавления соли) и стандартах. Двадцать пять микролитров образцов смешивали с 25 мкл буфера для образцов (190 мкл 2X буфера для образцов Lamaelli с 10 мкл 2-меркаптоэтанола). Образцы нагревали при 95 ° C в течение 10 мин на масляной бане. Рабочий буфер состоял из буфера 1X Tris / Glycine / SDS. Образцы (20 мкл или 10 мкл лестницы) загружали в лунки с 4-15% готовым гелем и проводили электрофорез при 100 В, 4 Вт, 40 мА в течение 40 мин.Затем гели окрашивали серебром в соответствии с протоколом, предоставленным набором Pierce Silver Stain. Необработанные и необработанные гели представлены на дополнительном рисунке 17.

Химотрипсин-полимерный синтез и характеристика

Химотрипсин (СТ) -полимеры, которые были синтезированы и охарактеризованы ранее 3 , были использованы в текущем исследовании для анализа осаждения сульфата аммония. Вкратце, CT был модифицирован 12 нейтральными инициаторами и длинноцепочечными полимерами цвиттерионного поли (карбоксибетаинметакрилата) (pCBMA), нейтрального поли (олигоэтиленгликольметакрилата) (pOEGMA), от нейтрального до положительного поли (диметиламиноэтилметакрилата) (pDMAEMA). (Метакрилат четвертичного аммония) (pQA) или отрицательный полисульфонатметакрилат (pSMA) выращивали с поверхности CT-нейтрального инициатора с использованием ATRP.Конъюгаты были охарактеризованы с помощью анализа BCA и динамического светорассеяния. Кроме того, проводили кислотный гидролиз для расщепления полимеров с последующим анализом GPC, как описано выше.

Краткое изложение отчета

Дополнительная информация о дизайне исследования доступна в Резюме отчета об исследовании природы, связанном с этой статьей.

Сульфат аммония — обзор

Процедура

Гомогенизация и фракционирование сульфата аммония. Все процедуры выполняются при 0–4 °.Замороженную печень крысы (180 г) гомогенизируют в смесителе Oster (бытового типа) на полной скорости в течение 4 мин в 720 мл буфера А, содержащего 1 мкл M EDTA, 1% (об. / Об.) Бычьей сыворотки, 10 мкМ N -тозил-1-фенилаланин хлорметилкетон (TPCK), 0,1 м. M фенилметилсульфонилфторид (PMSF) и 0,5% (мас. / Об.) Triton X-100. 10 Гомогенат центрифугируют при 9500 g в течение 15 мин. Супернатант пропускают через четыре слоя марли и доводят pH до 7.5 с 2 M Tris. Супернатант доводят до 30% насыщения сульфатом аммония (176 г / литр) путем медленного добавления твердой соли при постоянном перемешивании и оставляют перемешиваться в течение 20 минут перед центрифугированием при 9500 г в течение 20 минут. На этом этапе эффективно удаляется жир. Супернатант пропускают через четыре слоя марли, доводят до 45% насыщения сульфатом аммония (добавление 94 г / литр), как описано выше, и оставляют перемешиваться в течение 20 минут перед центрифугированием при 9500 г в течение 30 минут.Полученный супернатант доводят до 75% насыщения сульфатом аммония (добавление 210 г / литр), как описано выше, и оставляют перемешиваться в течение 20 минут перед центрифугированием при 9500 г в течение 20 минут. Осадок растворяют примерно в 100 мл буфера А и хранят при -80 °. Процедуру повторяют со второй партией 180 г печени, чтобы получить два неочищенных препарата фермента перед переходом к следующему этапу.

Колоночная хроматография на фенил-сефарозе и октил-сефарозе. Два препарата размораживают, объединяют и наносят на гель фенил-сефарозы (350 мл), уравновешенный буфером А, содержащим 1 M сульфат аммония, на воронке из спеченного стекла (диаметр 9 см). Гель промывают. с тем же буфером и фракцию, содержащую гидролазную активность HIB-CoA, не связанную с гелем, собирают. Твердый сульфат аммония, 382 г / литр (конечное, примерно 80% насыщение), медленно добавляют к фракции при постоянном перемешивании с последующим перемешиванием в течение еще 20 минут перед центрифугированием при 9500 g в течение 20 минут.Осадок растворяют примерно в 60 мл буфера А и наносят на гель октил-сефарозы (примерно 100 мл), уравновешенный буфером А, содержащим сульфат аммония 1 M , на фильтровальной воронке из спеченного стекла (диаметр 6 см). Гель промывают тем же буфером, и фракцию, содержащую гидролазную активность, не связанную с гелем, собирают и концентрируют путем осаждения сульфатом аммония, как описано выше.

Колоночная хроматография DEAE-Sephacel. Полученный осадок растворяют примерно в 35 мл буфера В и диализуют против 1 литра того же буфера в течение 18 часов с двумя заменами буфера.Агрегированный белок, образовавшийся во время диализа, удаляют центрифугированием при 9500 g в течение 10 мин. Прозрачный диализат наносят на колонку DEAE-Sephacel (2,5 × 15 см), уравновешенную буфером B. Колонку промывают тем же буфером при скорости потока примерно 65 мл / час до тех пор, пока поглощение элюата при 280 нм не уменьшится. почти до нуля (примерно 300 мл). Затем фермент элюируют из колонки буфером В, содержащим 0,1 M NaCl.

Колоночная хроматография на CM-сефарозе. Фракции с гидролазной активностью объединяют и диализуют против 2 литров буфера C в течение ночи. После удаления агрегированных белков, как описано выше, диализат наносят на колонку CM-Sepharose (2,5 × 8 см), уравновешенную тем же буфером. Колонку промывают буфером со скоростью примерно 75 мл / час до тех пор, пока поглощение элюата при 280 нм не станет близким к нулю (примерно 220 мл), а затем элюируют буфером C, содержащим 0,1 M NaCl.

Хроматография на колонке с гидроксилапатитом. Фракции с гидролазной активностью объединяют и концентрируют примерно до 5 мл путем ультрафильтрации (мембрана YM10). Концентрат разбавляют до 25 мл буфером D и снова концентрируют. Этот цикл разбавления и концентрирования повторяется снова для смены буфера. Полученный концентрат наносят на колонку с гидроксилапатитом (1,5 × 4 см), уравновешенную буфером D. Колонку промывают буфером со скоростью 20 мл / час до тех пор, пока поглощение элюата при 280 нм не снизится почти до нуля ( примерно 100 мл).Затем фермент элюируют из колонки буфером D, содержащим 50 мкл M фосфата калия (всего 75 мкл M фосфата калия). Гидролаза элюируется после основного пика белка на этой стадии (рис. 1). Фракции с основной активностью объединяют и добавляют Твин 20 до 0,01% (мас. / Об.). После этого этапа во все буферы необходимо добавить неионогенное детергент, чтобы свести к минимуму потерю фермента при адсорбции на пластиковых поверхностях.

Рис. 1. Профиль элюирования гидролазы HIB-CoA, очищенной с помощью хроматографии на колонке с гидроксилапатитом.(○) активность гидролазы HIB-CoA, (●) поглощение при 280 нм. Колонку элюировали буфером B, содержащим общую концентрацию фосфата калия 75 мкМ M (стрелка A), а затем буфером B, содержащим 500 мкл M фосфата калия (стрелка B). Фракции 22–44 были выделены для дальнейшей очистки.

[Адаптировано с разрешения Y. Shimomura, T. Murakami, N. Fujitsuka, N. Nakai, Y. Sato, S. Sugiyama, N. Shimomura, J. Irwin, J. W. Hawes, and R.A. Harris, J. Biol.Chem. , 269, 14248 (1994).]

Первая колоночная хроматография на сефакриле S-200. После концентрирования примерно до 1,5 мл с помощью ультрафильтрации препарат вносят в 10% (об. / Об.) В глицерин и наносят на колонку с сефакрилом S-200 (2,5 × 46,5 см), уравновешенную 50 м фосфата калия M , содержащего 0,1 мкл M EDTA, 0,1 M KCl и 0,05% (мас. / Об.) Твин 20 (pH 7,5 при 4 °). Колонку элюируют буфером со скоростью 17,5 мл / час.Фракции с относительно высокой удельной активностью гидролазы (фракции 38 и 39 на фиг. 2) объединяют и концентрируют примерно до 2 мл путем ультрафильтрации. Важно объединять и извлекать только фракции с соотношением активности гидролазы к поглощению при 280 нм более 200.

Рис. 2. Профиль элюирования гидролазы HIB-CoA, очищенной с помощью колоночной хроматографии на сефакриле S-200. (○) активность гидролазы HIB-CoA; (●) поглощение при 280 нм. Фракции 38 и 39 были выделены для дальнейшей очистки.Гидролаза HIB-CoA элюировалась при молекулярной массе 36000.

[Адаптировано с разрешения Y. Shimomura, T. Murakami, N. Fujitsuka, N. Nakai, Y. Sato, S. Sugiyama, N. Shimomura, J. Irwin, J. W. Hawes, and R.A. Harris, J. Biol. Chem. , 269, 14248 (1994).]

Колоночная хроматография на CoA-сефарозе. Буфер препарата заменяют на буфер С, содержащий 0,05% (мас. / Об.) Твин 20, с помощью метода ультрафильтрации, описанного выше. Препарат наносят на колонку CoA-Sepharose (1 мл), уравновешенную тем же буфером.Колонку промывают 14 мл буфера при скорости потока 30 мл / час и элюируют буфером C, содержащим 0,05% (мас. / Об.) Tween 20 и 0,1 M NaCl. Далее колонку элюируют тем же буфером, содержащим 0,5 M NaCl для удаления белков, связанных с колонкой, и снова уравновешивают буфером C, содержащим 0,05% (мас. / Об.) Твина 20. Фракции с гидролазной активностью, элюированные буфером, содержащим 0,1 M NaCl объединены. Концентрация NaCl снижается до менее 10 м M методом ультрафильтрации, и образец снова наносится на колонку CoA-Sepharose.Колонку промывают 10 мл уравновешивающего буфера и элюируют буфером D (pH 7,5), содержащим 0,05% (мас. / Об.) Твин 20.

Вторая хроматография на колонке с сефакрилом S-200. Элюат концентрируют примерно до 1,5 мл ультрафильтрацией, доводят до 10% (об. / Об.) В глицерине и снова вводят в колонку с сефакрилом S-200, как описано выше. Пиковые фракции белка, состоящие из одного полипептида (молекулярная масса 36000), как определено электрофорезом в додецилсульфат-полиакриламидном геле (SDS-PAGE), объединяют и хранят при -80 °.

Гидролаза HIB-CoA очищена в 7200 раз описанным здесь методом (таблица I).

Таблица I. Очистка 3-гидроксиизобутирил-КоА гидролазы из печени крысы a

(единиц / мг) 9035 2,934 9035
Фракция Белок (мг) Общая активность (единицы) Выход (%)
Экстракт печени b 62,700 3,480 100 0.056
(NH 4 ) 2 SO 4 (45–75%) осадок 12 900 2,451 70 0,19
Фенил-сефароза 4 NH ) 2 SO 4 осадок 4,073 1,896 54 0,47
Октил-сефароза- (NH 4 ) 2 SO 4 53 0.62
DEAE-Sephacel 500 864 25 1,73
CM-Sepharose 82,1 522 15 522 15 10 55,4
Сефакрил S-200 0,85 188 5,4222
CoA-Sepharose 0.40 161 4,6 403
Сефакрил S-200 0,29 126 3,6 427

Осаждение сульфата аммония 9

Введение

Растворимость белка зависит, среди прочего, от концентрация соли в растворе. При низких концентрациях присутствие соли стабилизирует различные заряженные группы на молекула белка, таким образом привлекая белок в раствор и повышение растворимости белка.Это широко известно как посол . Однако, поскольку концентрация соли повышена, точка максимальной растворимости белка обычно достиг. Дальнейшее увеличение концентрации соли означает, что все меньше и меньше воды доступно для солюбилизации белка. Наконец, белок начинает выпадать в осадок, когда нет достаточное количество молекул воды для взаимодействия с молекулами белка. Это явление осаждения белка в присутствии избыток соли известен как высаливание .

Многие типы солей были использованы для воздействия на белок. разделение и очистка высаливанием. Из этих солей сульфат аммония был наиболее широко используемым химическим веществом, потому что он обладает высокой растворимостью и относительно дешев. Так как ферменты — это белки, очистка ферментов может осуществляться следуя тому же набору процедур, что и для протеина, за исключением что необходимо уделить внимание рассмотрению необратимая потеря активности из-за денатурации при неблагоприятных условия.

Есть две основные процедуры высаливания. Во-первых процедура, либо насыщенный солевой раствор, либо порошкообразная соль кристаллы медленно добавляются к белковой смеси, чтобы вызвать концентрация соли в смеси. Например, соль концентрация достигает 25% насыщения, когда 1 мл насыщенного к 3 мл бессолевого белкового раствора добавляют солевой раствор; 50% за добавленные 3 мл; 75% на добавленные 9 мл; и так далее. В осажденный белок собирают и классифицируют в соответствии с концентрация солевого раствора, при которой он образуется.Этот частичный сбор отделенного продукта называется фракционирование . Например, фракция осажденного белок, собранный между 20 и 21% солевого насыщения, обычно называют фракцией 20-21%. Протеин фракции, собранные на ранних стадиях добавления соли менее растворимы в растворе соли, чем фракции собрал позже.

Принимая во внимание, что первый описанный метод использует , увеличивая концентрации соли, следующий альтернативный метод использует снижение концентрации соли.В этом альтернативном методе, как как можно больше белка сначала осаждается концентрированный солевой раствор. Затем серия холода (около 0ºC) растворы сульфата аммония уменьшающейся концентрации используется для селективной экстракции белковых компонентов, которые наиболее растворим при более высоких концентрациях сульфата аммония. В экстрагированный белок перекристаллизовывается и, таким образом, восстанавливается постепенно подогревая холодный раствор до комнатной температуры. Этот метод имеет дополнительные преимущества, заключающиеся в том, что экстракционная среда могут быть добавлены буферные или стабилизирующие агенты для сохранения максимальная активность ферментов.Эффективность восстановления обычно колеблется от 30 до 90% в зависимости от белка. В перекристаллизация белка при переносе экстракта в комнатная температура может возникнуть сразу или иногда может потребоваться много времени. часы. Тем не менее, очень редко рекристаллизация не дает происходить. Наличие мелких кристаллов в растворе может быть визуально определяется по помутнению.

Обсуждения

Чтобы обеспечить максимальный выход и избежать ненужной денатурации ферментов, большая часть работы по очистке белка обычно выполняются при низких температурах, т.е.е. от 0 до 40ºC. Однако работать в обычном режиме намного удобнее. лабораторное помещение в отличие от холодного помещения. Поскольку цель Этот эксперимент призван продемонстрировать использование общей очистки методы, если не указано иное, когда это действительно важно, процедуры будут проводиться при комнатной температуре без каких-либо значительная потеря образовательных ценностей.

Восстановление белка может иметь очень значительный экономический эффект. подразумеваемое.Поскольку фиксированная доля исходного белка остается растворимым в растворе, восстановление белка часто не на 100%. Конечно, доходность более 100% указывает на то, что что могут быть проблемы, связанные с методом анализа.

На типичной стадии приготовления или очистки белка, выполняемой в лаборатории, целью которой является выделение небольшого количества продукт для структурных или кинетических исследований, насыщенный аммоний раствор сульфата обычно используется.Это тоже процедура взятые в этом эксперименте. Однако в действительно больших масштабах промышленный процесс, лучше добавить сульфат аммония непосредственно в белковую смесь в виде порошка, чтобы эффект разбавления солевым раствором сводится к минимуму.

Denovo Biotechnology

В этой таблице указаны граммы твердого сульфата аммония (при 25 ° C), которые следует добавить к одному литру раствора для получения желаемого изменения концентрации сульфата аммония.Насыщенный раствор 4,1 М и требует 767 граммов соли на литр. Эта таблица основана на данных Green and Hughes in Methods Enzymol. 1, 67-90 (1955).

Как использовать таблицу концентрации сульфата аммония:

Выберите начальную концентрацию сульфата аммония в процентах от насыщения в левом столбце, затем выберите требуемую конечную концентрацию сульфата аммония в процентах от насыщения в верхней строке. Точка пересечения даст вам точное количество сульфата аммония (AmSO4) в граммах, необходимое для 1 литра исходного раствора.

0

10025352

0

10025352

0

0

196

270003 9 0347

449

900

237

237

237

237

0

%

10

15

20

25 3

25 3

35

40

45

50

55

55

55

70

75

80

85

90

90

0

56

84

114

144

176

196

196

196

313

351

390

430

472

516

561 9352 9352 9352

561

767

10

28

57

86

52 118

52 118

183

216 9000 3

251

288

326

365

406

449

49352 449

494 9352

494

694

15

28

57

88

107

120

3

52 220

153

52

153

52 220 294

333

373

415

459

506

556

556

556

556

29

59

78

91

123

155

155

300

340

382

424

471

520

569

619

619

619

619

30

49

61

93

125

158

19352 158

19352 19352 158

19352 19352 307

348

390

436

485

533

583

583

583

583

30

62

94

127

162

198

235

235

401

496

546

33

12

43

74

107

142

177

0003

177

0003 333

378

426

472

522

35

35

4

4

129

164

200

238

278

319

364 500003

900 25 40

31

63

97

132

168

205

168

205

2450003 375

420

469

45

32

65

65

210

250

293

339

383

431

69

900

33

66

101

137

176

214

52 256

52 256

52 256

52 256

392

55

33

67

103

141

141

9352

307

353

60

34

69

105

143

183

227

227

227

227

227

34

70

107

147

190

232

232

232

35

72

110

153

194

237

74

115

155

198

80

38

77

117

157

85

4

90

38

77

95

39

Аннотация

До того, как протеин A (кролик) или протеин G (грызуны) стал широко доступным и использовался для очистки IgG, использование «разрез» сульфата аммония был стандартным методом выделения IgG и других белков сыворотки.Добавление сульфата аммония снижает эффективную растворимость белков за счет прямой конкуренции за сайты связывания на поверхности белка. В полученные осажденные белки можно выделить центрифугированием. Концентрация сульфата аммония составляет от 40% до 50%. при осаждении IgG от большинства видов, поэтому обычно используется 50%. Поскольку другие белки могут быть «захвачены» внутри агрегированный белок, использование сульфата аммония не приводит к получению очищенной фракции антител и, следовательно, должно быть считается первым шагом в протоколе многоступенчатой ​​очистки антител.

МЕТОД

  • 1. Удалите нерастворимый материал из сыворотки, асцита или супернатанта клеточной культуры центрифугированием при 3000 g в течение 30 минут при 4 ° C.

  • 2. Перенести супернатант в химический стакан и медленно добавить насыщенный сульфат аммония до конечной концентрации 25% (мас. / Об.).

  • 3. Инкубируйте 5–15 ч при 4 ° C.

  • 4. Центрифуга при 3000 g в течение 30 мин при 4 ° C.

  • 5. Осторожно перелейте супернатант в свежий стакан.

  • 6. Добавьте насыщенный сульфат аммония (одна треть объема надосадочной жидкости), чтобы довести его конечную концентрацию до ~ 50%.

  • 7. Инкубируйте 5–15 ч при 4 ° C.

  • 8.Центрифуга 3000 g в течение 30 мин при 4 ° C.

  • 9. Удалите супернатант. Осторожно ресуспендируйте гранулы в 30–50% от первоначального объема. Перенести весь образец на диализ трубки (MWCO от 10 до 25 кДа).

  • 10. Проведите диализ против как минимум трех смен 1 × PBS в течение 24–48 часов.Любой флокулянт можно удалить центрифугированием. Если, однако антитело будет дополнительно очищено с помощью ионообменной хроматографии (например, DEAE), диализата с более низкой ионной силой следует использовать, например, 10 мМ Трис-буфер (pH 6,5) или аналогичный буфер.

  • 11. По окончании диализа определите концентрацию белка, измерив оптическую плотность при 280 нм.Для IgG A 280 1,35 = 1 мг / мл.

    • Эта фракция сырых антител может быть дополнительно очищена различными методами, включая очистку протеина A / G, анионообменную хроматографию с использованием диэтиламиноэтил (DEAE) -сефарозы или другие методы (аффинная хроматография, исключение по размеру или другие хроматографические методы).Если фракция IgG должна храниться в течение любого периода времени без дальнейшего После обработки его следует профильтровать через фильтр 0,45 мкм и хранить при 4 ° C.

.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *