Газ снг расшифровка: Dal 1977, i migliori impianti a metano e gpl per auto

Содержание

Определение синтетического природного газа SNG

 
Газгольдеры для хранения сжиженного углеводородного газа. Классификация и описание.

Газгольдеры представляют собой емкость для приема, хранения сжиженного углеводородного газа СУГ под избыточным давлением и его выдачи в распределительные газопроводы.
01 Сентября 2021 г.

Автономная газификация коттеджного поселка

Самым эффективным способом тепло- и энергоснабжения для населенного пункта является создание в рамках поселка централизованной системы на основе комплекса автономного газоснабжения. В случае, когда газифицировать необходимо не отдельно стоящий дом, а комплекс зданий — поселки, новые коттеджные застройки, дачные товарищества, загородный гостиничный или развлекательный комплекс, такое решение является экономически наиболее выгодным, экологичным и перспективным.
04 Августа 2021 г.

Оборудование для сжиженных углеводородных газов в лизинг

Группа компаний «Газовик» совместно с ООО «Открытая лизинговая компания» предлагает в лизинг как продукцию собственных заводов, так и других производителей.
06 Июля 2021 г.

СУГ в качестве резервного топлива котельных

Получение синтетического природного газа SNG и сжиженного углеводородного газа СУГ при помощи смесительных установок Metan для резервного газоснабжения котельных
12 Апреля 2021 г.

Особенности изготовления и монтажа сферических резервуаров для хранения сжиженного газа

Сферические резервуары, или как их еще называют шаровые резервуары, являются наиболее удобной формой для хранения сжиженного газа при высоких давлениях (до 2,0 МПа) и больших объемов
07 Февраля 2021 г.

Криогенные резервуары

Это цилиндрические резервуары (вертикальные или горизонтальные) объемом до 250 м3 и сферические ― объемом 1440 м3.
15 Января 2021 г.

ТУ 4859-004-12261875-2013. Насосно-счетная установка Vortex. Технические условия


08 Июня 2017 г.

Газы углеводородные сжиженные топливные. ГОСТ Р 52087-2003


26 Апреля 2017 г.

ВНТП 51-1-88 Ведомственные нормы на проектирование установок по производству и хранению сжиженного природного газа, изотермических хранилищ и газозаправочных станций (временные)


20 Февраля 2017 г.

 

Повышенный спрос на природный газ и уголь и их достаточно высокая стоимость в недалеком прошлом привели к необходимости получения альтернативного топлива, так называемого, синтетического природного газа.

В современной газовой промышленности существует несколько терминов, которые обозначают одно и то же газовое вещество. При этом следует отметить, что прямого соответствия между зарубежным и российским терминами не существует.

Понятие синтетического природного газа SNG, терминология

Для того, чтобы разобраться в терминологии, начнем с существующих понятий сжиженной пропан-бутановой смести: СНГ (сжиженный нефтяной газ), СУГ (сжиженный углеводородный газ), СПБ (сжиженный пропан-бутан). В мировой практике этим терминам соответствует термин LPG (Liquified Petroleum Gas).

Английскому же термину SNG в России нет прямого соответствия. SNG – аббревиатура для “synthetic (substitute) natural gas”, что переводится как «синтетический природный газ». При этом, синтетический природный газ нельзя сокращать до СПГ, что, в свою очередь, уже означает сжиженный природный газ. Далее, английский термин «природный газ» переводится как «natural gas». Получившаяся аббревиатура СНГ тоже не отражает правильной информации, так как означает «сжиженный нефтяной газ». «Синтетический газ», или «синтез-газ», не соответствует требуемому определению SNG, так как является промежуточным звеном для дальнейшей переработки в конечный химический продукт.

В результате терминологической путаницы понятий, в России термину «синтетический природный газ» соответствует все-таки английское сокращение SNG.

Что же это за синтетический природный газ? Это искусственно полученный газ после смешения газифицированного углеводородного сырья (угля, нефтяного сланца, другого топлива) и воздуха. Далее полученный газ очищается от загрязняющих веществ и других примесей. В результате получается газ, такой же чистый как природный, но не углеродно-нейтральный. Полученный газ обладает более высокими тепловыми характеристиками по сравнению с метаном. Если газ получать путем газификации биомасс, то синтетический природный газ становится углеродно-нейтральным. Такой газ получил название биологический синтетический природный газ, или Bio-SNG.

Получение синтетического природного газа SNG

Синтетический природный газ, или SNG, получается в смесительных установках низкого или высокого давления путем смешения сжиженной фазы газа (в основном, СУГ) и воздуха. Смесительные установки для получения синтетического природного газа состоят из обязательного технологического оборудования: емкости для хранения и подачи СУГ в смесительную систему, насосное оборудование, компрессоры для подачи воздуха и газа, испарительная установка СУГ, смесительная установка, ресивер-сепаратор (где происходит само смешение) и другое оборудование для надежной и безопасной эксплуатации системы. Схематично синтетический газ получается при смешении паровой фазы СУГ и воздуха в диффузоре, далее смесь SNG для окончательного смешения поступает в емкость-ресивер. Для получения синтетического газа одинакового состава на протяжении всего процесса смешения, давление воздуха и газа должно быть постоянным и неизменным. Полученный синтетический природный газ SNG должен обладать теми же химическими характеристиками, что и замещенный им газ.

Преимущества использования синтетического природного газа SNG

Кроме ценовой выгоды при выработке и использовании синтетического природного газа, существует и ряд других преимуществ. Например, производство SNG может работать круглогодично. Тепловые потери от его использования в системе теплоснабжения предприятий – всего 1 % по сравнению с 15% при использовании CУГ. Для перевода технологического оборудования (трубопроводы, клапаны, задвижки и т.п.) не требуется полная его замена, так как химический состав практически идентичен.

 

Таким образом, синтетический природный газ SNG доказал свою экономическую, технологическую и теплоэнергетическую выгоду, что отражается во все большем его использовании в различных областях промышленности.

22 Августа 2013 г.

 

Что такое СНГ и КПГ на маршрутных автобусах типа газель

Вопрос: Что такое СНГ и КПГ на маршрутных автобусах типа газель.

Ответ можно найти в техническом регламенте таможенного союза ТР ТС 018/2011

Раздел 9

9. Требования к двигателю и его системам

….

9.8. Система питания газобаллонных транспортных средств, ее размещение и установка должны соответствовать следующим требованиям:

9.8.1. На каждый газовый баллон должен иметься паспорт, оформленный его изготовителем.

9.8.2. На каждом газовом баллоне, установленном на транспортном средстве, должны быть четко нанесены нестираемым образом, по меньшей мере, следующие данные: серийный номер; обозначение «СНГ» или «КПГ». 

9.8.3. Газобаллонное оборудование на транспортных средствах в специально уполномоченных организациях подвергается периодическим испытаниям с периодичностью, совпадающей с периодичностью освидетельствования баллонов, установленной изготовителем баллонов и указанной в паспорте на баллон (баллоны). По результатам периодических испытаний специально уполномоченные организации оформляют свидетельство о проведении периодических испытаний газобаллонного оборудования, установленного на транспортном средстве.

9.8.4. Внесение изменений в конструкцию и комплектность установленного газобаллонного оборудования при эксплуатации не допускается. Изменения, вносимые при ремонте газобаллонного оборудования (замена редуктора или баллона), оформляются специально уполномоченными организациями свидетельством о соответствии газобаллонного оборудования требованиям безопасности.

9.8.5. Единые для государств – членов Таможенного союза формы документов, упомянутых в пунктах 9.8.1, 9.8.3 и 9.8.4 выше, устанавливаются решением Комиссии Таможенного союза. Указанные документы предъявляются при проведении проверки технического состояния транспортного средства.

9.8.6. Не допускается:

9.8.6.1. Использование газовых баллонов с истекшим сроком их периодического освидетельствования.

9.8.6.2. Нарушения крепления компонентов газобаллонного оборудования.

9.8.6.3. Утечки газа из элементов газобаллонного оборудования и в местах их соединений.

11. Требования к комплектности транспортных средств

11.8. На транспортные средства категорий М2 и М3, использующие в качестве топлива сжиженный нефтяной газ (СНГ) или компримированный природный газ (КПГ), наносятся опознавательные знаки, предусмотренные Правилами ЕЭК ООН № 67 и № 110, в виде ромба зеленого цвета с каймой белого цвета. В середине знака располагаются буквы: «СНГ» или «КПГ» (рисунок 11.1). Горизонтальная диагональ ромба 110-150 мм, вертикальная диагональ ромба 80-110 мм, ширина каймы 4-6 мм, высота букв более 25 мм, ширина букв более 4 мм. Опознавательные знаки размещаются спереди и сзади, а также по правому борту транспортного средства снаружи дверей.

 

Рисунок 11.1. Образец опознавательного знака для транспортных средств категорий М2 и М3, использующих в качестве топлива сжиженный нефтяной газ (СНГ) или компримированный природный газ (КПГ)

Часто задаваемые вопросы | Моторное топливо

  • Новости

    Важная информация для владельцев автомобилей на метане, ecogas, CNG, природном газе, экогазе

  • Сеть заправок

    Интерактивная карта заправочных пунктов и Автомобильных газонаполнительных компрессорных станций (АГНКС) в Республике Беларусь

  • Наши услуги

    Сервисные услуги по переоборудованию, ремонту и регулировке газобаллонного оборудования Газпром трансгаз Беларусь

    • Реализация природного газа

      Цена метана в Беларуси. Автомобильные газонаполнительные компрессорные станции Республики Беларусь. АГНКС в вашем регионе. АГНКС в Республике Беларусь

    • Освидетельствование баллонов

      Пункты по техническому освидетельствованию газовых баллонов, установленных на транспортных средствах ОАО «Газпром трансгаз Беларусь»

    • Переоборудование автомобилей

      Пункты переоборудования, ремонта и регулировки газобаллонного оборудования Газпром трансгаз Беларусь, ГБО

    • Дополнительные сервисные услуги

      Сервисные услуги по переоборудованию, ремонту и регулировке газобаллонного оборудования Газпром трансгаз Беларусь, ГБО

  • Полезная информация

    Полезная информация покупателям и владельцам автомобилей на метане, правила эксплуатации автомобилей, вопросы ГБО и партнёры

    • Это важно!

      Природный газ безопасен, отличить исправное газовое оборудование просто

    • Памятка покупателю авто

      Памятка покупателю автомобиля на метане, важная информация для владельцев автомобилей на природном газе

    • Каталог автомобилей

      Каталог автомобилей на газу, технические характеристики, описание, новинки, актуальная информация для автовладельцев, авто на ГБО

      • Легковые
      • Микроавтобусы
      • Автобусы
        • Производитель Республики Беларусь

          Каталог автомобилей на газу, технические характеристики, описание, новинки, актуальная информация для автовладельцев, авто на ГБО

        • Производитель Российской федерации

          Каталог автомобилей на газу, технические характеристики, описание, новинки, актуальная информация для автовладельцев, авто на ГБО

        • Зарубежный производитель

          Каталог автомобилей на газу, технические характеристики, описание, новинки, актуальная информация для автовладельцев, авто на ГБО

      • Грузовые
        • Зарубежный производитель

          Каталог автомобилей на газу, технические характеристики, описание, новинки, актуальная информация для автовладельцев, авто на ГБО

        • Производитель Республики Беларусь

          Каталог автомобилей на газу, технические характеристики, описание, новинки, актуальная информация для автовладельцев, авто на ГБО

        • Производитель Российской федерации

          Каталог автомобилей на газу, технические характеристики, описание, новинки, актуальная информация для автовладельцев, авто на ГБО

      • Ретро-автомобили
    • Информация от производителей

      Информация от производителей автобусов, автомобилей и техники использующих метан, природный газ в качестве моторного топлива

    • Нормативные документы

      Нормативные документы и материалы, ГОСТы и правила пожарной безопасности Республики Беларусь

    • Заправки зарубежья

      Зарубежный опыт и сеть метановых заправок за границей, карта заправок в Европе, России и Украине

    • Где еще освидетельствовать баллоны в Республике Беларусь

      Перечень организаций Республики Беларусь, имеющих разрешение (свидетельство) на право проведения технического освидетельствования сосудов, работающих под давлением (газовых баллонов, применяемых на транспортных средствах, использующих компримированный природный газ в качестве моторного топлива) с маркировкой клеймом

    • Наши партнеры в вопросах ГБО

      Партнеры в вопросах переоборудования автомобилей на метан, установки ГБО

    • Видеоматериалы
  • История

    История создания и развития сети АГНКС Газпром трансгаз Беларусь

  • Вопрос-ответ

    Сегодня метан стоит всего 0,75 руб куб.м. Часто задаваемые вопросы в установке, обслуживании, эксплуатации, переоборудовании автомобиля ГБО

    • Вопрос-ответ

      Сегодня метан стоит всего 0,75 руб куб.м. Часто задаваемые вопросы в установке, обслуживании, эксплуатации, переоборудовании автомобиля ГБО

    • Опросы
  • Контакты

    Контакты и телефоны начальников участков и обслуживания АГНКС, контакты по вопросам денежных остатков на топливной карте или ЭКИ (чип), форма обратной связи

СНГ — это… Что такое СНГ?

СНГ

«спаси нас, господи!»;
«с Новым годом!»;
«сбылись надежды Гитлера»;
«способ навредить Горбачеву»;
«самое настоящее говно»;
«союз нищих и голодных»;
«страны нетрезвых граждан»

фольклорн.

СНГ

«Самотлорнефтегаз»

ОАО

организация, энерг.

СНГ

сжиженный нефтяной газ
сжиженные нефтяные газы

энерг.

Словарь: С. Фадеев. Словарь сокращений современного русского языка. — С.-Пб.: Политехника, 1997. — 527 с.

СНГ

СургутНефтеГаз

энерг.

СНГ

Содружество независимых государств

с 8 декабря 1991

http://www.cis.minsk.by/​

Словарь: С. Фадеев. Словарь сокращений современного русского языка. — С.-Пб.: Политехника, 1997. — 527 с.

СНГ

Северноенефтегаз

Новосибирская обл., организация, энерг.

Источник: http://tnk-bp.ru/investors/disclosure/severnoeneftegaz/

СНГ

сит энд гоу

англ.: SnG, Sit’n’Go

разновидность турнирного покера

англ., карт.

Источник: http://www.poker-wiki.ru/poker/Турнир

СНГ

с Новым годом

снг

с начала года

в шапках таблиц

СНГ

старый Новый год

истор., РФ

  1. СНГ
  2. СНГ-2

Содружество непризнанных государств

Абхазия, Приднестровье, Южная Осетия

  1. СНГ

Источник: http://www.rg.ru/2006/06/14/sng-2-anons.html

СНГ

«Саханефтегаз»

ОАО, ННГК

http://sng.ykt.ru/​

г. Якутск, организация, энерг., Якутия

СНГ

«Саратовнефтегаз»

ОАО

г. Саратов, организация, энерг.

СНГ

«Самаранефтегаз»

ОАО
дочернее предприятие НК «ЮКОС»

г. Самара, организация, энерг.

Источник: http://www.ng.ru/regions/2004-12-09/4_samara.html

Словарь сокращений и аббревиатур. Академик. 2015.

виды газового топлива, из чего состоит и чем отличаются

Последнее обновление — 22 мая 2020 в 10:30

Основной альтернативой традиционному бензину или дизелю, является газомоторное топливо (ГМТ). Каким газом заправляют автомобили с ГБО, а также в чём отличие между ними вы узнаете из этой статьи.

Виды газового топлива

Условно ГМТ можно разделить по способу производства, агрегатному состоянию при использовании, хранении и транспортировке.

Расшифровка аббревиатур:

  • CNG (compressed natural gas) – компримированный (сжатый) природный газ (КПГ)
  • LPG (liquefied petroleum gas) – сжиженный нефтяной газ (СНГ)

Менее распространённые варианты:

  • LNG (liquefied natural gas) – сжиженный природный газ (СПГ)
  • CBG (compressed biogas) или LBG (liquefied biogas) – биотопливо.

Природный газ

Природным газом принято считать метан. Добывается он из недр земли через подземные или подводные (морские) скважины. В первоначальном варианте топливо содержит 75-98% метана (Ch5), а также множество различных примесей:

  1. механические (грунт)
  2. водяной пар
  3. этан C2H6
  4. пропан C3H8
  5. бутан C4h20
  6. азот N2
  7. этан C2H6
  8. пентан C5h22 и другие (зависит от места рождения).

После добычи, сырье подвергается очистке от загрязнений, воды (осушка). Затем методом сепарации происходит отделение сероводорода и других компонентов.

Так как метан не имеет запаха, почувствовать его утечку не возможно. Для безопасности в газ добавляют специальную жидкость одорант (этантиол, этилмеркаптан C2H5SH) из расчета 16 грамм на 1000 м3.

Чистый метан по магистралям, с помощью компрессорных станций создающих давление в трубе, направляется к автомобильным газонаполнительным компрессорным станциям. На АГНКС голубое топливо компримируют (сжимают) до давления 200-220 атм. Таким образом, получается готовый к использованию CNG газ для автотранспорта (характеристики и требования к КПГ регулируются ГОСТом 27577-2000).

Существует ещё один более выгодный метод транспортировки метана. Очищенный природный газ пропускают через систему эжекторов, где при расширении его температура поэтапно понижается до температуры кипения -163°C, после чего метан переходит в сжиженное состояние. Основным преимуществом такого способа является уменьшение объёма газа в 600 раз.

Перевозку и хранение жидкого топлива осуществляют в специальных криогенных ёмкостях, которые, по сути, являются термосами. Цистерна объёмом 25 кубометров вмещает 10 тонн СПГ/LNG.

Затем у сжиженного природного газа может быть два пути:

  1. обратный перевод в газообразное состояние при помощи испарителей
  2. использование СПГ как топливо

Последний пункт является очень перспективным для автомобильного транспорта преимущественно коммерческого направления, из-за скопления в жидком метане огромного количества тепловой энергии при относительно низком давлении в криоёмкости (от 5-16 атм.).

Основные преимущества сжатого метана, как и СПГ – это их экономические и экологические показатели. К тому же природный газ легче воздуха, в этом смысле он менее опасен при утечке чем, например пропан. Однако газы метана являются токсичными (4 класс опасности).

Главным фактором медленного распространения CNG, является отсутствие достаточного количества автозаправочных станций. В настоящее время на территории России насчитывается, порядка 330 АГНКС не считая передвижных заправщиков (ПАГЗ), которые в основном применяются для нужд предприятий.

Техника и инфраструктура под LNG только начинают появляться, поэтому более широкое применение на авто пока имеет КПГ.

Заправка криобака магистрального тягача на СПГ

Сжиженный нефтяной газ

Ввиду доступности и пониженных требований к конструкции баллонов, ещё большее распространение в качестве газомоторного топлива получил состав пропана (C3H8) с бутаном (C4h20).

Пропан-бутановую смесь выделяют из добытого газоконденсата, а также при извлечении и глубокой переработке нефти. При нефтеперегонке образуется так называемый попутный нефтяной газ (ПНГ), из него отделяют сжиженный углеводородный. Затем происходит разделение СУГ на составляющие компоненты, один из которых — это сжиженный нефтяной газ. Для разных сфер применения СНГ бывает:

  • СПБА — смесь пропана-бутана автомобильная
  • ПА — пропан автомобильный
  • ПТ – пропан технический
  • ПБТ – пропан-бутан технический.

Пропан тяжелее воздуха, поэтому при утечке может скапливаться в нишах и закрытых помещениях (смотровая яма, гараж). Взрывоопасность паров ПБ в воздухе 2,3-9,5 % при нормальном давлении и температуре 20°C, метана 5-15%. СНГ малотоксичен.

LPG топливо имеет температуру кипения -43 градуса по Цельсию, при её превышении и атмосферном давлении горючее переходит в парообразное состояние. Избыточное давление паров составляет 16 атм (при температуре 45°C). В сжиженном состоянии объём СПБ уменьшается до 250-300 раз, концентрируя большое количество энергии.

Согласно ГОСТу 52087-2003 ПА должен содержать 85% пропана (±10%), СПБА 50% (±10%). Топливо, как и метан, подвергается одоризации (за исключением правил указанных ГОСТом).

Применение технического пропана и смеси ПТ, допустимо в качестве моторного топлива автомобиля, во всех климатических зонах с температурой окружающей среды до -20°C.

Октановое число пропана 105, у метана 110. По сравнению с бензином после сгорания СНГ и КПГ топлива, вредные выбросы снижаются до 10 раз.

Биотопливо

Биогаз — по сути тот же метан, полученный из растительного, животного сырья, а также различных органических отходов. CBG/LBG обладает схожими характеристиками.

Основное преимущество биометана заключается в том, что его производство никак не связано с добычей природных ископаемых. Генерируют его искусственным путём в специальных реакторах. Процесс происходит за счёт естественной жизнедеятельности бактерий . После очистки газа от сероводорода получается топливо с содержанием метана до 98%.

Применение биогаза как ГМТ актуально для сельскохозяйственных предприятий и перерабатывающих отходы организаций.

СНГ: что дальше? — РИА Новости, 26.05.2021

Александр Бабаков, руководитель фракции «РОДИНА» в Государственной Думе, секретарь президиума ЦС партии «Справедливая Россия».

15 лет минуло, как появилась аббревиатура СНГ. Мы используем это название для обозначения огромного пространства, которое осталось после раcпада СССР. Но общего понимания того, каково истинное предназначение  Содружества независимых государств, у нас так и не сложилось. Спроси десяток россиян — будь то политики или простые труженики, — что такое СНГ, ответы будут разные, порой диаметрально противоположные. Для одних, и их, к сожалению, меньшинство, СНГ — это политико-экономическая межгосударственная структура, имеющая перспективы для дальнейшего развития. Для других — вынужденно созданное искусственное образование, придуманное в качестве промежуточного этапа перед тем, как окончательно разбежаться по национальным квартирам, или, как сейчас модно выражаться, для «цивилизованного развода». Мне ближе первое определение. Но действительность показывает: если активно не вмешаться, верх возьмет вторая формулировка.

Считаю, что при создании СНГ лидерами бывших советских республик все-таки двигало интуитивное осознание необходимости сохранить все лучшее, что было в СССР. Под лучшим я подразумеваю экономическую интеграцию, многовековое культурное взаимопроникновение, тесные человеческие контакты, чувство единства, позволяющего сообща решать масштабные созидательные задачи и отражать внешние угрозы.

В современном мире государства объективно стремятся к интеграции.  Это мы наблюдаем не только в Европе. И на постсоветском пространстве интеграционные процессы — не дань моде. Без интеграции — экономической, политической, военной — новые государства вряд ли в состоянии весомо заявить о себе. Даже выбравшие европейскую ориентацию Латвия, Литва и Эстония в жизненно важных для их экономик сферах продолжают участвовать в интеграционных инициативах СНГ, например, в Совещании руководителей железнодорожных ведомств.

Форма интеграции может быть разной. Возьмем ту же единую Европу. Она, как известно, начиналась с Европейского объединения угля и стали, затем появились Европейское экономическое сообщество и Европейское сообщество по атомной энергии. Ныне мы видим Европейский союз, который имеет единую валюту и стремится к более высокой форме межгосударственной интеграции, разрабатывая собственную Конституцию и т.д.

Хочу надеяться, что СНГ пойдет похожим путем. При этом вовсе не обязательно фанатично держаться за название «СНГ». Надо отдавать себе отчет в том, что логика экономического развития будет подталкивать страны Содружества к выходу за пределы регионального рынка и поиску новых партнеров.

Сейчас дела в области экономического взаимодействия складываются не самым успешным образом. До сих пор сказываются последствия «революционного перелома» начала 90-х годов, когда в стремлении к национальному обособлению были нарушены наработанные связи, а новые либо не сложились, либо имеют ущербный характер. Неокрепшие экономики и рынки оказались открыты настежь для иностранного капитала, который стал последовательно изводить национальные промышленные возможности ради собственных производителей. Печальные результаты такой политики испытали на себе все республики бывшего СССР за исключением Белоруссии. Теперь, чтобы установить отвечающий национальным интересам баланс присутствия на наших рынках иностранного и местного капитала, мы тем более должны действовать сплоченно.

В этом процессе важно искать точки взаимного пересечения интересов, которые позволят форсировать экономический рост. При этом вряд ли стоит делать ставку на  сиюминутную выгоду, важнее увидеть перспективу. Даже если тот или иной товар сейчас выгодно завозить из-за рубежа, мы все равно должны стремиться к тому, чтобы развивать производство этой продукции у себя или у своих соседей по СНГ. Такой выбор обоснован комплексным характером национальных интересов: инвестиции в производство в долгосрочном плане материализуются в новые рабочие места, современную инфраструктуру, будут способствовать увеличению покупательной способности населения.

Важнейшей сферой, в которой переплетаются, а нередко и перехлестываются интересы стран СНГ, является энергетика. Государства-экспортеры нефти и газа пока зачастую выступают в качестве конкурентов в плане доступа на мировой рынок. Такое положение вещей позволяет внешним силам манипулировать энергетическими рычагами в регионе СНГ, что вряд ли идет на пользу всем. Решение в этой ситуации напрашивается одно: требуется четкая координация политики в этой области.

В энергетической сфере остается еще одна серьезная проблема, касающаяся условий поставок нефти и газа в страны СНГ. Россия стремится к выстраиванию таких связей на рыночных принципах, но это зачастую не встречает понимания у партнеров по СНГ. Убежден, что  переходить на реальные цены в снабжении энергоносителями надо, но делать это следовало бы постепенно, не с такими издержками, как сейчас. Иначе мы будем стимулировать усиление внутренних противоречий в большинстве стран и провоцировать рост недоверия к политическому курсу России на постсоветском пространстве в целом.

Только общими усилиями можно найти решение острейшей проблемы постсоветского региона — неразвитости рынков труда. Россия может и должна ужесточать миграционное законодательство и методы борьбы с трудовыми нелегалами. Но одним этим порядка не добьёшься. Через межгосударственные механизмы сотрудничества партнеры по СНГ в состоянии серьезно и комплексно заняться структурированием рынков труда, создавая дополнительные рабочие места в тех странах, откуда идут наиболее интенсивные потоки трудовых мигрантов. В немалой степени это также и задача крупных корпораций и бизнес-структур, которые активно используют труд мигрантов, в том числе нелегальных.  Если удастся сообща цивилизованно и, самое главное, в духе взаимного уважения решить эту проблему, то со временем такое унижающее национальное достоинство явление, как нежелательные «гастарбайтеры», исчезнет само собой.

Особую актуальность в последнее время приобретает укрепление и расширение оборонного единства и сотрудничества стран-членов  СНГ. Рамки Содружества остаются уникальным механизмом для совершенствования подобного взаимодействия на благо каждой страны и одновременно отстаивания совместных интересов. Доказывать целесообразность интеграции в военной сфере нет нужды: это и поддержание территориальной целостности, и защита от террористических и других внешних угроз. Не менее значимыми остаются удержания суверенных прав в сфере обладания и распоряжения природными ресурсами,  и  контроль над жизненно важной для участников Содружества транспортной инфраструктурой, и обеспечение свободного доступа к мировым водным маршрутам и многое другое.

Непреходящую ценность, объединяющую все без исключения страны СНГ и даже нынешних членов ЕС — Латвию, Литву и Эстонию, — составляет общее культурное пространство. Оно также, к великому сожалению, серьезно пострадало в результате распада СССР. В советское  время многие именитые артисты из национальных республик имели возможность выступать перед десятками миллионов зрителей как в своей стране, так и за рубежом. Собственно и свое всенародное признание они получили во многом благодаря масштабам Советского Союза. В наше время они вряд ли этим смогут похвастаться. Их творчество помимо своих стран остается востребованным разве что в России, да и то не всегда. Даже нынешние «европейцы» — страны Балтии — по-прежнему преимущественно живут в культурном пространстве России и СНГ, равно как и их культурный потенциал (музыка, театр, кино) востребованы в основном здесь же.

Автогаз – виды, характеристики – лучший газ для авто

Оказывается, когда говорят об автогазе, водители разных автомобилей и из стран могут иметь в виду совершенно разные вещи. Давайте вместе упорядочим наши знания относительно газообразных топлив для автомобилей.

Существут несколько видов газообразного топлива для двигателей внутреннего сгорания: пропан-бутан, метан, водород и генераторный газ. Также есть разные формы хранения газов в баке на борту автомобиля. Об этом и поговорим. Оговорим, однако, что не каждый автогаз можно приобрести на АЗС в Украине, даже если это будет фирменная брендовая сеть. А некоторых видов газа не удастся найти на заправке никогда.

Пропан-бутан

На самом деле это смесь двух газов, которая с успехом используется в качестве моторного топлива. Пропан-бутан является сопутствующим продуктом переработки нефти на нефтеперерабатывающих заводах, также этот продукт освобождается во время добычи нефти. Этот газ в автомобилях используется в сжиженном виде. И на АЗС, и в автомобиле он хранится в баллонах под давлением порядка 16 атм.

ЧИТАЙТЕ ТАКЖЕ: Авто на водороде или на электричестве: что лучше

В сокращенном виде пропан-бутан обозначают как СНГ (в Европе LPG) – сжиженный нефтяной газ. Реже употребляется аббревиатура СУГ (рус.) – сжиженный углеводородный газ. Именно под СНГ переоборудуют свои легковушки украинские автомобилисты, когда устанавливают ГБО, и именно СНГ/LPG подразумевается, когда речь идет об автогазе. Цена за литр пропан-бутана (аналог 1 л бензина) в Украине и Европе обычно составляет около 50-60 % от цены бензина А-95.

Пропан-бутан продается на большинстве АЗК в Украине, также существуют отдельные «газовые» заправки.

Сжиженный пропан-бутан (LPG) – самый распространенный в мире вид газового топлива для авто. Среди его преимуществ – небольшой баллон

Метан

Его называют еще природным газом, хотя и пропан с бутаном отнюдь не искусственные. Метан добывают как полезное ископаемое, и это тот самый газ, что приходит в наши дома по трубам. Собственно, есть способ, как использовать для автомобиля газ из трубы, но об этом ниже. В Украине метан на транспорте используется в сжатом до 200 – 250 атмосфер виде, его еще называют компримированным. Такая форма хранения требует громоздких и тяжелых емкостей – баллонов с толстыми стенками.

Сжатый метан (природный газ) CNG нечасто используют на легковых авто, поскольку для него нужны тяжелые и громоздкие баллоны

Поэтому абсолютное большинство переоборудований “на метан” приходится на грузовые машины и автобусы. Сжатый метан маркируется как СПГ — сжатый природный газ, за рубежом эта аббревиатура имеет вид CNG. Цена сжатого метана в Украине сейчас примерно равна цене пропан-бутана, но в некоторых странах она в 1,5 – 2 раза ниже в цене, чем пропан-LPG.

Кроме того, метан на транспорте используется и в сжиженном виде, в таком случае его называют LNG — Liquified Natural Gas. Для сжижения газ охлаждают до – 160о С, а затем закачивают в соответствующие емкости. Именно под такое топливо LNG выпускают свои газифицированы машины многочисленные европейские и некоторые азиатские автобренды, хотя заводских версий под сжатый метан CNG тоже достаточно.

Водород

Автомобили, использующие водород в качестве топлива для двигателя внутреннего сгорания, сегодня изрядная редкость – так же, как и водородные заправки. Но такие выпускались или выпускаются до сих пор – под уважаемыми марками BMW, Toyota, Hyundai, Mazda. Они используют сжиженный водород, для чего на борту нужно иметь громоздкие и тяжелые баллоны с многослойной термоизоляцией.

ЧИТАЙТЕ ТАКЖЕ: что делать, чтобы сэкономить еще больше топлива

Кроме того, водород настолько летуч, что просачивается через любые соединения: за десять дней из бака машины испаряются половина его содержимого. Интересно, однако, что водород можно получать дома – путем электролиза воды или из природного газа, для чего существуют специальные “домашние” установки. В большинстве стран, где водород для автомобиля можно купить, он стоит дороже бензина.

Водород в качестве топлива для автомобильных ДВС вряд ли имеет реальную перспективу в ближайшее десятилетие, но свои преимущества у него есть

Генераторный газ

Это газ, который автомобиль производит у себя на борту. Другими словами, это автомобили, которые работают на дровах. Газовый генератор, заряженный дровами, обеспечивает такие условия их сгорания, что в качестве продукта сгорания выделяется горючий газ. Его и используют в качестве топлива для двигателя. Этот газ называют также газогенераторным. Его не хранят в баллонах или других емкостях, газген устроен так, что весь выработанный им газ сразу потребляется двигателем.

В принципе, газовым генератором можно оборудовать любой карбюраторный автомобиль, но значительную часть полезного объема кузова отберет газовый генератор. Калорийность генераторного газа намного ниже, чем бензина, поэтому тяговые характеристики машины при его использовании заметно ухудшаются.

Во время войн и экономических потрясений газогенераторные автомобили выпускались серийно. ЗИС-21 и ГАЗ-42 вместо бензина потребляли дрова

Можно ли газ из трубы заправить в авто

Да, можно. Природный газ в трубе – это тот самый метан, который закачивают в баллоны на газонаполнительных заправочных станциях. Но проблема именно в том, что в баллонах на борту авто надо достичь давления 200 – 250 атм, а для этого нужен особый компрессор. Тем не менее подобные устройства существуют, и даже известны примеры построенных на их основе коммерческих заправочных станций.

Названия газов, выступающих как моторные топлива

Вид газа

Общеупотребительное название

Краткое обозначение

Cжиженный нефтяной газ, Сжиженный углеводородный газ (Liquified Natural Gas)

Пропан-бутан, пропан

СНГ, СУГ

LPG

Сжатый природный газ

(Compressed Natural Gas)

Метан

СПГ

CNG

Cжиженный природный газ (Liquified Natural Gas)

Метан

LNG

Водород

Водород

H2

Газогенераторный газ, генераторный газ

Газген

Рекомендация Авто24

Выбор вида топлива зависит в первую очередь от условий эксплуатации. Если говорить об автогазе в Украине, обратите внимание не только на суточный пробег, но и на наличие рядом заправочной станции с соответствующим газом. Причем очень желательно, чтобы это был сетевой автозаправочный комплекс с качественным топливом и сервисом высокого уровня. Ведь на примитивных заправках no name есть вероятность быть обманутым, тем более что газ дает возможностей для злоупотреблений больше, чем жидкое топливо.

ЧИТАЙТЕ также: Украинцы значительно реже стали регистрировать ГБО

Рационализация и прогнозирование выборочного декодирования псевдоуридин-модифицированных бессмысленных и смысловых кодонов

Abstract

Стоп-или бессмысленный кодон — это внутрикадровый триплет в матричной РНК, который сигнализирует о завершении трансляции. Одной общей чертой, общей для всех трех бессмысленных кодонов (UAA, UAG и UGA), является уридин, присутствующий в положении первого кодона. Недавно было показано, что превращение этого уридина в псевдоуридин () подавляет прекращение трансляции как in vitro, так и in vivo.Более того, декодирование псевдоуридилированных бессмысленных кодонов сопровождается включением двух специфических аминокислот бессмысленным кодон-зависимым образом. Ψ отличается от уридина единственной группой N 1 H в положении C5; Как Ψ подавляет завершение и, что более важно, делает возможным выборочное декодирование, плохо изучено. Здесь мы предоставляем молекулярные объяснения того, как псевдоуридилированные стоп-кодоны избирательно декодируются. В нашем анализе используются кристаллические структуры рибосом в различных состояниях трансляции, чтобы рассмотреть ослабленное взаимодействие с фактором высвобождения; термодинамические и геометрические аспекты пар оснований кодон-антикодон для ранжирования и исключения пар мРНК-тРНК; механизм проверки верности пары кодон-антикодон рибосомой для оценки неканонических пар оснований кодон-антикодон и роли воды.Мы также рассматриваем определенные модификации тРНК, которые мешают Ψ-скоординированной воде в большой бороздке мини-спирали кодон-антикодон. Наш анализ бессмысленных кодонов позволяет предсказывать потенциальные свойства декодирования для Ψ-модифицированных смысловых кодонов, такие как декодирование UU потенциально как Cys и Tyr. Наши результаты обеспечивают молекулярное обоснование замечательной динамики декодирования рибосом и понимание возможного перепрограммирования генетического кода с использованием модификаций мРНК.

Ключевые слова: псевдоуридин , нонсенс-кодон, молекулярное моделирование, рибосома, тРНК

ВВЕДЕНИЕ

Псевдоуридин (Ψ) представляет собой изомер С5-гликозидного вращения уридина ().Он обнаружен в транспортной и рибосомной РНК (тРНК, рРНК) во всех трех царствах жизни и в сплайсосомной малой ядерной РНК (мяРНК) у эукариот. Хотя является наиболее распространенной модификацией РНК (Hamma and Ferre-D’Amare 2006), еще предстоит определить, присутствует ли Ψ также в матричной РНК (мРНК). Первичным химическим изменением, происходящим при превращении U в, является добавление донора водородной связи через группу N 1 H. В спирали РНК этот донор водородных связей находится в большой бороздке и может заякорить молекулу воды, чтобы связать взаимодействия этой группы N 1 H с ее собственной и предшествующими фосфатными группами (Arnez and Steitz 1994).

Структурное сравнение U и Ψ и предполагаемая роль снижения узнавания по факторам высвобождения. ( A ) Химическая структура U и. Частичный заряд обозначен для каждого атома, а рассчитанные дипольные моменты двух оснований (дебай или D) показаны в виде массивов. ( B ) Распознавание U в бессмысленном кодоне с помощью RF1 (код PDB: 3D5A) и RF2 (2Wh4). ( C ) Сравнение дипольного момента притяжения между белком фактора высвобождения и азотистым основанием, когда либо U, либо (предполагая, что занимает то же положение, что и U) присутствует в активном сайте RF1.Также показана дополнительная молекула воды, присутствующая только с Ψ-модифицированными нонсенс-кодонами.

В недавнем исследовании Yu и коллеги продемонстрировали, что замена уридина во всех трех бессмысленных кодонах на Ψ подавляет терминацию трансляции как in vitro, так и в Saccharomyces cerevisiae (Karijolich and Yu 2011). Более того, они показали, что-модифицированные нонсенс-кодоны выборочно декодируются как специфические аминокислоты (). В частности, AA и ΨAG читаются как серин и треонин, тогда как ΨGA читаются как фенилаланин и тирозин.

ТАБЛИЦА 1.

Аминокислоты, включенные в-содержащие нонсенс-кодоны

Декодирование немодифицированных кодонов мРНК осуществляется в несколько этапов и находится под строгим контролем рибосомы. Кодоны мРНК обычно распознаются тРНК с комплементарными последовательностями Уотсона-Крика и иногда колеблющимися парами оснований в положении третьего кодона. Watson-Crick и определенные пары оснований колебания позволяют родственным тРНК термодинамически превосходить другие виды тРНК, последовательности которых будут вводить несовпадающие пары оснований с кодоном мРНК.Кроме того, пары оснований мРНК-тРНК в A-сайте рибосомы исследуются в процессе, называемом «тест A-сайта», чтобы гарантировать точность декодированного кодона (Ogle et al. 2001; Schuwirth et al. 2005; Сельмер и др., 2006). В частности, тест A-сайта выполняется небольшой рибосомной субъединицей через A1493 и A1492 спирали 44 в 16S рРНК (в дальнейшем используется нумерация Thermus thermophilus ), которые образуют обширную сеть водородных связей в малой бороздке с пары оснований мРНК-тРНК в положении первого и второго кодона и G530 петли 530 в положении третьего кодона (Ogle et al.2001). Такие взаимодействия малых бороздок универсально сохраняются и служат ключевым шагом в контроле точности процесса декодирования (Lescoute and Westhof 2006). Многие тРНК сильно модифицированы по нуклеотиду 37, ближайшему 3′-нуклеотиду к третьему антикодонному нуклеотиду, который считывает первое положение кодона мРНК. Модификация нуклеотида 37 также может влиять на точность декодирования нуклеотида первого кодона.

Когда первая позиция бессмысленных кодонов изменяется с U на, модифицированные кодоны не только эффективно подавляются при остановке трансляции, они также избирательно декодируются как всего лишь две аминокислоты (Karijolich and Yu 2011).Хотя шаблон декодирования модифицированных бессмысленных кодонов включает пары оснований / A типа Уотсона-Крика, например, в тРНК Ser , присутствие Ψ в первом положении кодона также позволяет декодировать тРНК с U36 в их третьем положении антикодона. , например, в тРНК Thr . Это открывает возможность для несовпадающей пары оснований Ψ / U мРНК-тРНК. Кроме того, присутствие приводит к дополнительным изменениям в правилах спаривания оснований во второй или даже в третьей парах кодон-антикодон, например.g., несовпадение A / G в случае декодирования AA / AG во второй позиции и в случае декодирования GA в третьей позиции (). Этим экспериментальным наблюдениям не было дано никакого рационального объяснения.

Здесь мы предлагаем молекулярное объяснение того, как три-модифицированных нонсенс-кодона подавляются как терминирующие кодоны и, что более важно, выборочно декодируются как специфические аминокислоты. Пользуясь преимуществом большого количества доступных кристаллических структур рибосом в различных состояниях трансляции, мы предлагаем молекулярные модели по избирательному декодированию, зондированию A-сайта, термодинамическим и геометрическим соображениям, а также влиянию определенных модификаций тРНК на выборочное декодирование-модифицированной бессмыслицы. кодоны.Поскольку структуры эукариотических рибосом, содержащие как мРНК, так и тРНК, недоступны, наш анализ должен был опираться на структуры бактериальных рибосом. Из-за участия многих партнеров по взаимодействию было невозможно предсказать точную долю двух аминокислот, которые избирательно декодируют-содержащие бессмысленные кодоны. Несмотря на эти предостережения, наши результаты дают представление о замечательной динамике декодирования рибосом и приводят к предсказаниям потенциальных правил декодирования для Ψ-модифицированных смысловых кодонов, которые должны быть полезны при рациональном перепрограммировании генетических кодов с использованием модификаций РНК.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Ψ должен ускользать от распознавания факторами высвобождения

Нонсенс-кодоны в A-сайте рибосомы обычно распознаются факторами высвобождения, тем самым вызывая диссоциацию рибосомных субъединиц и высвобождая вновь синтезированную пептидную цепь. Чтобы позволить спаривание оснований с антикодонами и последующее включение аминокислот, β-модифицированные нонсенс-кодоны должны сначала избежать распознавания факторами высвобождения. У дрожжей все три бессмысленных кодона распознаются eRF1, который образует функциональный комплекс с eRF3, тогда как у прокариот два белка (RF1 и RF2) распознают бессмысленные кодоны.Из-за отсутствия структурной информации о eRF1 в контексте распознавания бессмысленных кодонов в рибосоме, наш анализ проводился с прокариотическими факторами высвобождения (RF1 и RF2), где доступна обширная структурная информация (Коростелев и др., 2008; Лаурберг и др. 2008; Weixlbaumer et al. 2008; Korostelev et al. 2010), несмотря на то, что бессмысленные эксперименты по подавлению кодонов проводились на дрожжах (Karijolich and Yu 2011).

Распознавание нонсенс-кодонов включает в себя многочисленные взаимодействия различных типов (полярные, гидрофобные, ионные, стэкинг и т. Д.)) для E. coli, RF1 и RF2 (Sund et al. 2010). Поскольку взаимодействия уридина (или) с лицевой стороной Ватсона-Крика кажутся неадекватными для объяснения пониженной аффинности связывания с факторами высвобождения, мы предполагаем, что определенные различия между уридином и Ψ, должно быть, ослабили распознавание Ψ-модифицированных бессмысленных кодонов посредством фактор выпуска.

Первое отличие — это дипольный момент: хотя разница величин дипольных моментов U и base мала, угловая разница очевидна (∼27.9 °) (). N-конец спирали α5 из домена 2 RF1 находится в непосредственной близости от основания уридина (), а проекция диполя U на диполь α5 на ∼30% больше, чем для Ψ (). Поскольку наиболее благоприятным взаимодействием является коллинеарный дипольный момент, то есть угол θ = 0, больший угол к дипольному моменту спирали α5 для Ψ по сравнению с U предполагает, что его взаимодействие со спиралью α5 ослаблено. Кроме того, больший угол Ψ диполя должен испытывать в ~ 1,4 раза больший крутящий момент, чем U.Этот крутящий момент стремится выровнять диполь Ψ с диполем α-спирали фактора завершения, таким образом уговаривая Ψ в неидеальном положении для образования водородных связей и высвобождения факторов (). Вычисление энергии всех атомов дает оценку -3,2 ккал / моль в пользу U относительно при связывании RF1; следовательно, ожидается, что связывание Ψ-содержащих стоп-кодонов с факторами высвобождения значительно снизится. Хотя структуры факторов высвобождения прокариот значительно отличаются от таковых у эукариот (Song et al.2000; Cheng et al. 2009), а атомные детали распознавания оснований с помощью eRF1 все еще неясны, ротационная изомеризация от U до Ψ, как ожидается, всегда изменяет диполь-дипольное взаимодействие между связанным основанием и остатками белка в eRF1.

Во-вторых, молекула воды присутствует только в-модифицированных кодонах через водородные связи с N 1 H и 5 ‘фосфатным кислородом (; Arnez and Steitz 1994; Yarian et al. 1999). Эта молекула воды может препятствовать взаимодействию фактора высвобождения из-за стерических препятствий или уменьшения свободы вращения основания.

Более слабое сродство, происходящее из-за измененных диполей и опосредованной водой геометрии оснований, может позволить некоторым видам тРНК конкурировать за связывание модифицированного бессмысленного кодона.

Обилие тРНК не может объяснить специфичность включения аминокислот

Одно тривиальное объяснение специфического включения определенных аминокислот для Ψ-модифицированного нонсенс-кодона () состоит в том, что декодирование может регулироваться изобилием молекул тРНК in vivo. Ранее мы разработали метод микроматрицы тРНК для измерения относительного содержания молекул тРНК в любом биологическом образце (Dittmar et al.2006; Заборске и др. 2009 г.). Наши предыдущие результаты для дрожжей предполагают, что уровень заряда обычно высок для всех тРНК в оптимальных условиях роста (Zaborske et al. 2009). Следовательно, для декодирования Ψ-модифицированных нонсенс-кодонов следует принимать во внимание только обилие клеточной тРНК. Однако корреляция между количеством тРНК и избирательным декодированием β-модифицированного нонсенс-кодона не наблюдается у дрожжей (данные Tuller et al. 2010). Например, распространенность всех изоакцепторов тРНК Thr ниже среднего, но треонин легко включается в кодоны AA и AG.Кроме того, ни одна из пяти наиболее распространенных тРНК не соответствует фактическим аминокислотам, включенным в β-модифицированные нонсенс-кодоны. Эти результаты показывают, что наблюдаемая специфичность включения аминокислот не определяется количеством видов тРНК в клетках.

Относительное содержание тРНК в дрожжах, измеренное с помощью микроматрицы. тРНК, которые могут декодировать Ψ-содержащие бессмысленные кодоны, сортируются на справа . Показана сумма процентного содержания видов тРНК Ser и тРНК Thr .Последовательность антикодона для каждой тРНК указана в скобках.

Выбор тРНК-кандидатов для декодирования Ψ-модифицированных нонсенс-кодонов

Конкуренция различных видов тРНК за связывание со смысловым кодоном частично определяется термодинамическими предпочтениями Уотсона-Крика и определенных пар оснований колебания в кодоне-антикодоне. -спираль в А-сайте рибосомы. В отличие от смысловых кодонов, для бессмысленных кодонов не существует дополнительных партнеров тРНК Уотсона-Крика. Следовательно, декодирование Ψ-модифицированных бессмысленных кодонов должно включать несовпадающие пары оснований.Кроме того, несовпадающая мини-спираль мРНК-тРНК должна выдержать тест рибосомного A-сайта, чтобы обеспечить удлинение растущей пептидной цепи.

Ближайшие кандидаты тРНК включают две пары оснований Уотсона-Крика в первой и второй позиции, но несоответствие в третьей позиции. Использование таких кандидатов тРНК может предсказать декодирование AA / ΨAG как тирозин и ΨGA как цистеин или триптофан, но ни один из этих прогнозов не совпадает с экспериментальными результатами (Karijolich and Yu 2011).

Многие конкурирующие тРНК можно легко исключить, применив простые правила к геометрии пар оснований, образованных между кодоном мРНК и антикодоном тРНК.Первая и вторая пары оснований кодон-антикодон тщательно проверяются рибосомой в A-сайте. Геометрия пары оснований первой пары кодон-антикодон особенно важна из-за ее наиболее обширных взаимодействий с остатком A1493 16S рРНК (Ogle et al. 2001; Lescoute and Westhof 2006). Поскольку канонические пары оснований Уотсона-Крика относятся к типу цис Вт / Вт (номенклатура Леонтиса-Вестхофа) (Леонтис и Вестхоф, 2001), жизнеспособные несоответствия для первых пар кодон-антикодон также должны быть цис Вт / Геометрия W.Для положения первого кодона молекулы тРНК, имеющие либо A, либо U в соответствующем положении, эффективно декодируют β-модифицированные нонсенс-кодоны (). Таким образом, пары Ψ / A и Ψ / U (предшествующий кодон — нуклеотид) должны быть разрешены. В самом деле, пары U / A и U / U могут присутствовать в конформации cis W / W (Leontis and Westhof 2001). Это легко исключает тРНК, содержащие G или C в третьей позиции антикодона, оставляя для дальнейшего рассмотрения только тРНК с A или U в третьей позиции антикодона.Для второй и третьей позиций экспериментально декодированные бессмысленные кодоны указывают на то, что допускаются гетеропуриновые несовпадения (A / G или G / A), которые также можно найти в состоянии цис Вт / Вт. Гомо-пуриновые несовпадения можно отбросить, поскольку пара оснований G / G не может встречаться в геометрии цис W / W, а конформация A / A цис W / W имеет только одну водородную связь между двумя основаниями и, следовательно, нестабильно (Leontis et al. 2002).

Хотя колебание пурин-пиримидин должно быть разрешено для второй и третьей пары кодон-антикодон, A / C здесь не рассматривается, потому что аденозин должен быть протонирован, чтобы способствовать образованию пары оснований, даже если A / C cis W / W пара изостерична колебанию G / U (Stombaugh et al.2009 г.). Состояние протонирования пары A / C, как известно, зависит от числа окружающих ее пар оснований (Siegfried et al.2010), и короткая мини-спираль мРНК-тРНК в A-сайте вряд ли будет поддерживать протонирование аденозин.

Гетеропуриновые пары оснований могут существовать во многих конформациях, две из которых наиболее распространены: имино ( цис, W / W, тип VIII по Сенгеру) и сдвиговая ( транс, S / H, тип XI по Сенгеру). Контекст последовательности вокруг пары гетеропуринов определяет, какой из них предпочтительнее другого (Виллескас-Диаз и Захариас 2003; Йилдирим и Тернер 2005).например, транс, H / S) или G / A (то есть транс, S / H), будет препятствовать проверке достоверности с помощью остатка A1492 рРНК, который воспринимает сахарный край второй пары кодон-антикодон. В состоянии срезанной пары оснований атом O2 ‘второго нуклеотида мРНК не расположен должным образом, чтобы образовать рибозную застежку-молнию с A1492. Следовательно, пара оснований гетеропурина во втором положении не может находиться в срезанном состоянии. Что касается состояния имино, конформация cis W / W предлагает большее расстояние C1′-C1 ‘(∼12.5 Å по сравнению с ∼10,3 Å для канонического Уотсона-Крика), но его искажение на спирали РНК минимально. Например, сахарные складки тандемных несоответствий G / A в файле 1MIS базы данных белков (PDB) (Wu and Turner 1996) находятся в конформации C3’-эндо против , которая такая же, как в канонической двойной спирали. A1492 может коаксировать имино-состояние пары оснований G / A или A / G с помощью механизма индуцированной подгонки (Williamson 2000), который затем сделает возможным правильное распознавание пары оснований малой бороздки с помощью A1492 рРНК.Инозин в положении 34 в нескольких тРНК декодирует положение третьего кодона; поскольку он также декодирует аденозин, несовпадение аденозина и инозина также должно допускаться в позиции третьего кодона (Murphy and Ramakrishnan 2004; Murphy et al. 2004). В этих исследованиях было обнаружено, что несоответствие A / I находится в цис Вт / Вт с обоими сахарами в конформации анти .

Взятые вместе, эти простые правила легко исключают большинство видов тРНК из соображений декодирования Ψ-модифицированных бессмысленных кодонов ().Эти результаты, однако, еще не объясняют, как мини-спираль мРНК-тРНК, содержащая различные несовпадающие пары оснований, может удовлетворять тесту A-сайта рибосомы. Мы предоставим подробные объяснения этого в следующих разделах.

ТАБЛИЦА 2.

Подробные объяснения простых правил, используемых для сужения тРНК для декодирования Ψ-модифицированных бессмысленных кодонов

Молекулярное моделирование РНК с использованием MC-Sym

Хотя моделирование молекулярной динамики (МД) обычно выполняется для понимания химические и биологические процессы, в случае РНК, однако, было показано, что текущие силовые поля создают нестабильные траектории или макроскопические ожидаемые значения, не соответствующие экспериментальным результатам (Yildirim et al.2009; Гун и Сяо 2010). Поэтому мы решили применить пакет молекулярного моделирования РНК, MC-Sym (Major et al. 1991; Major 2003) для создания моделей на атомном уровне, как это было сделано для других систем (Major et al. 1993; Lemieux et al. . 1998; Ван и др. 2011). MC-Sym не основан на энергетических соображениях взаимодействия пар оснований, способен обращаться к конкретным типам пар оснований во время моделирования и позволяет систематически и исчерпывающе исследовать гипотезы о типах пар оснований.

Мы применили MC-Sym для тестирования и получения различных мини-спиралей мРНК-тРНК в контексте спирали 44 и петли 530 рибосомы ().В нашем случае MC-Sym используется для выборки конформационного пространства нуклеотидов, составляющих мини-спираль мРНК-тРНК, и остатков рРНК, непосредственно участвующих в зондировании этой мини-спирали, которые соответствуют A1493 и A1492 из спирали 44 и G530 из спирали. цикл 530. Затем минимизация энергии применяется к наборам-приманкам MC-Sym, и энергетический профиль каждого набора-приманки сравнивается, чтобы выявить, какие виды тРНК с наибольшей вероятностью декодируют конкретный кодон мРНК. Профиль энергии, полученный из MC-Sym, представляет собой кривую энергии моделей в данном наборе ложных целей.Более отрицательный энергетический профиль, основанный на нашей структурной гипотезе мини-спирали кодон-антикодон для данного вида тРНК, увеличивает вероятность использования этой тРНК для декодирования. В настоящее время наши энергетические расчеты могут только ранжировать каждый рассматриваемый вид тРНК по их вероятности декодировать Ψ-модифицированные кодоны.

Шаги моделирования для восстановления A-сайта. ( A ) Сначала с помощью компьютерной программы MC-Sym отбирают образцы нуклеотида 530 (фиолетовый) петли 530 в рРНК и нуклеотидов 34 (зеленый), 35 (морской) и 36 (оранжевый) антикодоновой петли.Отношение смежности (смежность) используется для позиционирования нуклеотида 36 относительно 37 и так далее до нуклеотида 34 в тРНК. Взаимосвязь стэка (стопка) позиции 530 относительно 518. ( B ) Во-вторых, нуклеотиды информационной РНК (1, красный; 2, зеленый; 3, морской) и двух аденозинов 1492 (оранжевый) и 1493 (фиолетовый). ) в рРНК отбираются в контексте данной конформации, выбранной на шаге 1. Здесь нуклеотиды в мРНК позиционируются с использованием парного отношения (пары) по отношению к их парному партнеру в тРНК (антикодон 36 позиции мРНК 1, 35 позиции 2 и 34 позиции 3).А1493 пар рРНК с 36 тРНК, а А1492 пар рРНК с остатком 2 мРНК.

Измерения стабильности обычно выражаются в виде ΔΔG. Хотя вычисление значений ΔΔG in silico может быть выполнено с использованием термодинамических циклов, это очень затратно в вычислительном отношении (Yildirim et al. 2009). Здесь мы сообщаем о стабильности центра декодирования рибосомы как внутреннюю энергию или ΔH. ΔH касается оценки высвобождения энергии при образовании водородной связи или других связывающих сил, когда атомные группы сближаются из бесконечности, в отличие от ΔΔG, которая связана с разницей энергии водородных связей, когда молекулы объединяются, по сравнению с тем, когда эти молекулы изолированы. в воде.Хотя наши вычисления не принимают во внимание энтропию, они все же дают ценную информацию о способности различных тРНК декодировать определенные кодоны. Энтропийные факторы можно оценить, но вопросы силового поля еще не решены должным образом для молекулярной динамики нуклеиновых кислот, поэтому расчет ΔS в настоящее время выходит за рамки данной работы.

Поскольку не сообщалось о структурах эукариотических 80S, содержащих тРНК, связанную с кодоном мРНК в тестовой конфигурации A-сайта, структура 70S (1IBM) из Thermus thermophilus используется в качестве шаблона для моделирования, хотя Ψ-модифицированный Эксперименты по кодонам были выполнены на дрожжах.Таким образом, можно утверждать, что прокариотический шаблон не подходит для моделирования результатов трансляционного декодирования, полученных из дрожжей. Действительно, эукариотическая 80S рибосома более сложна и связана дополнительными белками по сравнению с прокариотической 70S рибосомой; однако центр декодирования A-сайта содержит универсально консервативные и важные нуклеотиды: A1492, A1493 и G530 (Ben-Shem et al. 2010; Rabl et al. 2011). Между прокариотической и эукариотической рибосомами существуют структурные различия, напримерво внутренней петле, которая закрепляет нуклеотиды A1492 и A1493. Поскольку мы моделируем «включенное» или активированное состояние этой внутренней петли, структурная матрица прокариотической рибосомы должна быть сопоставима с эукариотической рибосомой, поскольку как прокариотические, так и эукариотические активированные состояния A-сайта должны быть по существу одинаковыми (Kondo and Westhof 2008 г.).

Хотя недавно также сообщалось о проверке Р-сайта рибосомы (Zaher and Green 2009), мы не построили модели для Р-сайта, так как нет известных прямых считываний мини-спирали мРНК-тРНК какой-либо рРНК или рибосомной белки в P-сайте.Мы также не принимали во внимание роль A1913 23S рРНК при декодировании положения третьего кодона (Ortiz-Meoz and Green 2011). A1913 расположен на вершине основания первого кодона и перпендикулярен первой паре оснований кодона; он не контактирует напрямую с позицией третьего кодона. A1913 может служить храповым замком, помогающим предотвратить соскальзывание мини-спирали мРНК-тРНК к Р-сайту. Все наши модели имеют плоские пары оснований, которые не должны мешать A1913.

Вместо того, чтобы подробно рассматривать каждую пару оснований кодон-антикодон, мы описываем несколько тематических исследований, чтобы проиллюстрировать соображения, которые вошли в наше моделирование. Полные описания исключений для AA представлены в, для ΨGA in и для ΨAG in.

ТАБЛИЦА 3.

Описание исключения для тРНК с A или U в третьем положении антикодона при декодировании нонсенс-кодона ΨAA

ТАБЛИЦА 4.

Описание исключения для тРНК с A или U в третье положение антикодона при декодировании нонсенс-кодона ΨGA

ТАБЛИЦА 5.

Описание исключения для тРНК с A или U в третьей позиции антикодона при декодировании нонсенс-кодона ΨAG

Пример I: Декодирование ΨAA с помощью тРНК

Thr (UGU)

U / U цис W / W пара оснований жизнеспособна в мини-спирали мРНК-тРНК в первой парной позиции кодона с третьим антикодоновым нуклеотидом тРНК Thr (UGU) . Однако ширина малой бороздки такой пары U / U должна поддерживаться должным образом, чтобы A1493, который взаимодействует с обоими нуклеотидами этой пары оснований, мог правильно ее распознать.Мы считаем, что для того, чтобы расширить малую бороздку пары оснований U / U, необходимо одновременное выполнение двух предварительных условий: молекулы воды на границе Уотсона-Крика и гетеропуриновое несоответствие во втором положении кодона, спаривающемся с средний нуклеотид антикодона тРНК. Следовательно, тРНК, несущие уридин в положении 36, можно исключить, за исключением случаев, когда имеется несоответствие гетеропуринов во втором положении кодона.

Мы предполагаем, что единственной тРНК, способной декодировать ΨAA для треонина, является тРНК Thr (UGU) .В этом случае пары оснований кодон-антикодон содержат пару / U в первом положении и пару имино A / G во втором положении. Чтобы объяснить режим декодирования на молекулярном уровне, с помощью MC-Sym было проведено обширное моделирование, а выходные модели были подвергнуты минимизации энергии (подробности см. В разделе «Материалы и методы»). Одно лучшее решение из ансамбля показано в. В первом положении пара оснований / U цис W / W типа состоит из одной прямой водородной связи между атомом O2 1 из мРНК и N3 из U36 из тРНК и двух опосредованных водой взаимодействий, соединяющих Ψ1-O2 / U36-O4 и Ψ1-N3 / U36-O2 (, вверху).Физическое присутствие молекулы воды W1 также расширяет малую бороздку в дополнение к образованию водородной связи с N3 в A1493, чтобы обеспечить распознавание. Этот тип пары оснований U / U, соединенных мостиком молекулы воды, можно найти в спирали 44 рибосомы в непосредственной близости от центра декодирования A1492-A1493 (Vicens and Westhof 2003). Эта пара оснований U / U с мостиковой водой изостерична каноническим парам оснований Уотсона-Крика и сохраняет расстояние C1′-C1 ‘в стандартной спирали A-формы. Во втором положении присутствует имино пара A / G, и эта пара гетеропурин-пурин расширяет малую бороздку (, в середине).Хотя водородная связь с G530 отсутствует, нуклеозид A1492, который взаимодействует только с нуклеотидом кодона из мРНК, а не с нуклеотидом антикодона из тРНК, все же может образовывать рибозную застежку-молнию. Что касается других способов спаривания оснований, конформация цис H / W не поддерживается, поскольку атом H8 в A2 будет конфликтовать с A1492-h3 в A-минорном взаимодействии. MC-Sym также может построить пару trans H / S A / G, но энергия этой конформации неблагоприятна. На третьей позиции, как и ожидалось, размещена каноническая пара A / U Watson-Crick.

Роли мотивов ля минор в декодирующем распознавании. ( A ) пары оснований тРНК-мРНК между тРНК Thr (UGU) и AA. ( B ) пары оснований тРНК-мРНК между тРНК Tyr (GUA) и ΨGA. ( C ) пары оснований тРНК-мРНК между тРНК Phe (GAA) и UUU, взятые из кристаллической структуры 1IBM, также показаны для сравнения. Расстояния между атомами C1 ‘всех пар оснований измеряются и аннотируются.Черные пунктирные линии представляют водородные связи, а серые линии — более слабые взаимодействия. Атомы углерода окрашены в зеленый цвет (для кристаллических структур) или голубой (моделируемые структуры), азот — в синий, кислород — в красный, а водород — в белый.

Энергетический профиль предсказывает ранжирование тРНК Thr (UGU) > тРНК Ser (UGU) ≥ тРНК Tyr (GUA) >> тРНК6 Asn ≈ (GUA) тРНК Lys (UUU) ().Экспериментальные результаты показывают, что AA в основном декодируется Thr и Ser, что хорошо согласуется с нашими оценками. тРНК Asn (GUU) и тРНК Lys (UUU) содержат пару Ψ / U в первой позиции, но не имеют гетеропуриновой пары A / G во второй позиции. Полученные энергетические кривые хорошо согласуются с нашей гипотезой о том, что пара Ψ / U жизнеспособна только тогда, когда она сосуществует с парой A / G. тРНК Tyr (GUA) — единственная тРНК, которая показывает сравнимый энергетический профиль с тРНК Ser (UGU) , но тРНК Tyr (GUA) не используется при декодировании.В настоящее время мы не знаем, почему тРНК Tyr (GUA) вытесняется на А-сайте.

Практический пример II: Декодирование GA с помощью тРНК

Tyr (GUA)

Согласно рассмотренным выше соображениям, тирозин может быть включен после декодирования GA антикодоном GUA. Это означает, что последовательная пара оснований G / U в первой и второй позиции и пара A / G в третьей позиции допустимы. Обзоры PDB показывают, что пары G / U в основном находятся в форме колебания ( цис Вт / Вт, Saenger тип XXVIII), хотя существуют другие схемы водородных связей, которые встречаются гораздо реже, чем цис Вт / Вт. тип.Обзоры PDB также показывают, что пара оснований A / G в третьей позиции может принадлежать к одному из четырех типов: цис, Вт / Вт («имино», тип VIII по Сенгеру), цис, Вт / в (Saenger тип IX), транс, W / S (Saenger, тип X) или trans, S / H («срезанный», Saenger, тип XI). Всего с помощью MC-Sym было проверено восемь структурных гипотез (два типа G / U, умноженные на четыре типа A / G). Обнаружено, что пара G / U вобуляции предпочтительнее всех других типов пар G / U во втором положении (, в середине).Что касается третьей пары оснований, пара A / G типа trans H / S исключается, поскольку она препятствует взаимодействию G530 с рибозой нуклеотида третьего кодона. Пара A / G цис H / W типа кажется энергетически предпочтительной (): аденозин находится в конформации syn по отношению к своему сахару и образует две прямые водородные связи с противоположным гуанозином (внизу). Ширина малой бороздки составляет ~ 11,1 Å, что близко к 10,3 Å для канонической пары оснований. Конформация цис W / W не может быть исключена исключительно на основе моделирования, но ее расстояние C1′-C1 ‘шире, чем cis H / W, и она менее предпочтительна с энергетической точки зрения ().Наконец, тРНК Leu (UAA) , тРНК Ile (IAU), и тРНК Ile (UAU) , которые нельзя исключить простыми принципами режима спаривания оснований, кажутся энергично переиграл. тРНК Cys (GCA) не может быть исключена из энергетических соображений; тем не менее, остаток цистеина экспериментально не наблюдался в декодированном кодоне ΨGA (Karijolich and Yu 2011). Мы объясним, почему Cys не декодируется, в разделе «Роль Ψ в декодировании» ниже.

Пример III: Декодирование AG

ΨAG выборочно декодируется как серин и треонин, что похоже на AA, но отличается наблюдаемым соотношением включения аминокислот. Применение исключений и эффективное сужение числа кандидатов тРНК до тРНК Ser (UGA) , тРНК Ser (CGA) , тРНК Thr (UGU) и тРНК Thr (ГЕ) . Чтобы быть особенно осторожными, тРНК Lys (CUU) и тРНК Lys (UUU) также используются в расчете энергии набора-приманки в дополнение к этим четырем тРНК ().Энергетически предпочтительны тРНК Ser (CGA) (линия 1) и тРНК Thr (CGU) (линия 2), что хорошо согласуется с экспериментальными результатами. Поскольку режимы спаривания оснований, наблюдаемые для этих двух тРНК, очень похожи на те, которые показаны в ( цис W / W, тип Ψ / U и Ψ / A [, имино-пара A / G [, и обе тРНК образуют регулярную структуру Ватсона). Crick G / C в третьей позиции пары кодон-антикодон), они не проиллюстрированы подробно, чтобы избежать избыточности.

Роль Ψ в декодировании

На первой позиции мини-спирали между ΨGA и тРНК Tyr (GUA) , а также AA / ΨAG с тРНК Ser , Ψ находится в антигенах конформации и образует пару оснований Уотсона-Крика с антикодоном A36 в тРНК.Атом N1 в протонирован при физиологическом pH и находится в большой бороздке; N 1 H часто участвует во взаимодействиях водородных связей с фосфатной группой (ами) остатка или соседнего нуклеотида (Arnez and Steitz 1994; Yarian et al. 1999). Например, пара Ψ / A встроена в основу антикодона некоторых видов тРНК (; Delagoutte et al. 2000). В этом спиральном контексте предыдущие исследования показали, что пара 27 / A43 более стабильна по сравнению с парой U / A и должна рассматриваться как альтернативная пара оснований для CG (Price and Gray 1998).Мы использовали конформацию пары Ψ27 / A43 из файла PDB 1F7U (Delagoutte et al., 2000) и наложили ее на первую пару U / A мини-спирали кодон-антикодон A-сайта из файла PDB 2HGP (Юсупова и др. 2006 г.). Поскольку 5′-фосфатные группы 27 и U очень хорошо перекрываются друг с другом (), во время декодирования GA тРНК Tyr (GUA) , аналогичная молекула воды также должна соединить атом N1 с его 5 ‘фосфат и для увеличения жесткости пары оснований ().Изгиб основной цепи мРНК между A- и P-сайтами, как известно, вносит вклад в различение родственной мини-спирали мРНК-тРНК по сравнению с ней (Sanbonmatsu and Joseph 2003). Следовательно, большая жесткость пары Ψ / A, обусловленная в первую очередь молекулой воды, может способствовать образованию несовпадающих пар оснований во втором и третьем положениях мини-спирали, что в конечном итоге помогает мини-спирали пройти тест на селективность. через излом мРНК. Точно так же молекула воды удерживается в большой канавке в паре Ψ / U (например,g., спаривание AA с тРНК Thr (UGU) ) может вносить благоприятный вклад в формирование мини-спирали. Наконец, с кинетической точки зрения, повышенная жесткость фосфатного остова, соединяющего кодон в A-сайте с кодоном в P-сайте, может помочь замедлить скорость транслокации мРНК (Rodnina and Wintermeyer 2001), тем самым обеспечивая дополнительное время. для образования несовпадающих пар оснований в A-сайте.

Предлагаемые роли в декодировании. ( A ) В структуре с высоким разрешением 1F7U молекула воды соединяет атом N1 и две фосфатные группы основной цепи.( B ) Наложение Ψ27 / A43 (1F7U) на U / A, первую пару в A-участке 2HGP. ( C ) Смоделированная пара Ψ / из мини-спирали, образованная между ΨGA и тРНК Tyr (GUA) , наложенная на Ψ27 / A43 (1F7U). ( D ) Химическая структура i 6 A37 на слева и молекулярный вид, сделанный из 3I8G, показывающий положение группы i 6 на справа . ( E ) Заполненные пробелом иллюстрации мини-спирали тРНК-мРНК A-сайта показывают, что аккомодация гидрофобной модификации i 6 менее благоприятна для в положении первого кодона по сравнению с уридином.Цветовая кодировка такая же, как в A37, за исключением того, что атомы углерода в A37 окрашены в пурпурный цвет.

Нуклеотидные модификации в петле антикодона тРНК могут быть другим фактором, который влияет на декодирование β-модифицированных нонсенс-кодонов. Например, известно, что гипермодифицированные A37 и U34 увеличивают не только стабильность мини-спирали мРНК-тРНК, но и способность декодирования тРНК (Bjork et al. 1987; Agris et al. 1997; Murphy et al. 2004; Weixlbaumer и др. 2007; Дженнер и др. 2010). В дрожжах как треонилкарбамоильная (t 6 A), так и изопентенильная (i 6 A) группы являются известными модификациями аминогруппы N6 A37: первая играет роль в тРНК, таких как тРНК Thr , декодирующих кодоны ANN, в то время как i 6 A37 часто присутствует в тРНК, которые читают кодоны UNN, такие как тРНК Ser , тРНК Cys и тРНК Tyr (Hall 1970; Nishimura 1972; Persson et al.1994; Agris et al. 2007). Поскольку RR-кодоны являются предметом данного исследования, мы сосредоточили внимание в первую очередь на изопентенильной модификации. Известно, что отсутствие модификации i 6 A37 снижает активность подавления UGA-вставки серина и вставки тирозина, и считается, что химическая группа i 6 влияет на взаимодействие кодон-антикодон (Bjork et al. 1987) . Недавняя кристаллическая структура рибосомы (Jenner et al. 2010) показывает, что изопентенильная группа A37 в тРНК A-сайта находится в большой бороздке мини-спирали мРНК-тРНК прямо на вершине первой пары кодон-антикодон, а также проецируется к 5 ‘стороне антикодона ().Когда Ψ присутствует в положении первого кодона, его группа N 1 H обладает повышенной способностью (по сравнению с группой C 5 H уридина) удерживать молекулу (ы) воды в большой бороздке. В результате вокруг модификации i 6 , состоящей из этих малоподвижных молекул воды, может образоваться сольватационная оболочка (). Поскольку изопентенильная группа является гидрофобной, эта сольватационная оболочка, вероятно, не в пользу i 6 A37, содержащего тРНК, при декодировании Ψ-модифицированных нонсенс-кодонов.

Две из трех рассматриваемых тРНК из верхней тройки для декодирования ΨGA, тРНК Cys (GCA) и тРНК Tyr (GUA) содержат i 6 модификацию A37 в дрожжах (; Sprinzl и Василенко 2005).Присутствие i 6 A37 должно снизить ранжирование обеих тРНК. К сожалению, мы не можем подсчитать количественные вклады модификации i 6 A37 в энергию центра декодирования. Для тРНК Cys (GCA) это зависимое от модификации уменьшение может стать достаточно большим, чтобы упасть в рейтинге ниже тРНК Phe (GAA) , что объясняет, почему Phe используется для декодирования ΨGA вместо Cys.

Перепрограммирование генетического кода с использованием смысловых кодонов Ψ in

Насколько нам известно, в мРНК пока не обнаружено.Учитывая недавние открытия, что определенные модификации в сплайсосомной РНК U2 могут быть индуцированы в условиях стресса (Wu et al. 2011), возможно, что также может присутствовать в мРНК при определенных физиологических условиях. Если это так, модификация мРНК с помощью in смысловых кодонов может перепрограммировать смысловой кодон, позволяя читать его как аминокислоты, отличные от генетического кода. Поэтому мы выполнили моделирование, чтобы предсказать, как Ψ-модифицированные смысловые кодоны могут быть декодированы, начиная с UU, полученного из кодона UUU для фенилаланина (;).

ТАБЛИЦА 6.

Прогнозирование тРНК, которые могут декодировать кодон UU

Прогнозирование декодирования кодона UU с помощью тРНК Cys (GCA) и тРНК Tyr (GUA) (GUA) (GUA) ( A ) пары оснований тРНК-мРНК между тРНК Cys (GCA) и ΨUU. ( B ) пары оснований тРНК-мРНК между тРНК Tyr (GUA) и ΨUU. ( C ) пары оснований тРНК-мРНК между тРНК Phe (GAA) и UUU, взятые из кристаллической структуры 1IBM, также показаны для сравнения.Используется та же цветовая кодировка, что и у.

На основе принципов, описанных выше для избирательного декодирования Ψ-модифицированных нонсенс-кодонов, тРНК с антикодонами Leu, Ser и Trp могут быть легко удалены. Остальные кандидаты были подвергнуты анализу распределения энергии ловушек. Двумя кандидатами с наивысшим рейтингом являются тРНК Cys (GCA) и тРНК Tyr (GUA) (). Интересно, что в модели мини-спирали мРНК-тРНК, образованной между ΨUU и тРНК Cys (GCA) или тРНК Tyr (GUA) , цис W / W типа U / C или U / U-пара наблюдается для второй пары кодон-антикодон, а также обнаружено, что молекула воды находится в непосредственной близости от малой бороздки (, в середине), аналогично ситуации с парой Ψ / U для декодирования AA / ΨAG.Возможно, что такие молекулы воды всегда могут помочь мини-спирали пережить тест рибосомного A-участка за счет расширения малой бороздки пары оснований пиримидин-пиримидин. Наше предсказание декодирования ΨUU согласуется с экспериментальными результатами (Y-T Yu, личн. Комм.).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Молекулярное моделирование

Все попытки молекулярного моделирования начинаются с файла PDB 1IBM (Ogle et al. 2001). Существуют более свежие структуры 70S, но их A-сайт идеально совпадает с сайтом 1IBM (например.г., Selmer et al. 2006 г.). Из этой матрицы мы извлекли нуклеотиды 30–40 из цепи «Y» для тРНК антикодоновой петли, нуклеотиды 1406–1410 и 1490–1495 цепи «A» для спирали 44 и нуклеотиды 516–521 и 528–533 цепи « A ”для петли 530. Нуклеотиды на краях этих различных стержней и петель сохраняются фиксированными в трехмерном пространстве, таким образом обеспечивая структурный контекст для построения события декодирования β-содержащих нонсенс-кодонов в рибосомном A-сайте.

Мы использовали компьютерную программу MC-Sym для построения трехмерных моделей центра декодирования рибосомы с атомарной точностью (Major et al.1991; Major 2003; Parisien and Major 2008). В типичном испытании моделирования частичная структура берется в качестве входных данных MC-Sym, и затем к этой частичной структуре добавляются нуклеотиды. Добавление нуклеотидов осуществляется на основе отношений (укладка, спаривание и т. Д.) Между нуклеотидами. Например, он может загрузить центр декодирования рибосомы и добавить нуклеотид 530 в виде стека поверх нуклеотида 518 (). Стекинг-конформации — это те, которые составлены из существующих на основе решенных структур в PDB (Берман и др.2000). MC-Sym — это программа для решения проблем удовлетворения ограничений (CSP), что означает, что любая структура выходного решения удовлетворяет всем структурным ограничениям, указанным во входном скрипте. Структурные ограничения — это явные ограничения расстояния или стерические столкновения между тяжелыми атомами, а также отношения между нуклеотидами, указанные во входном скрипте. Использование MC-Sym позволяет явно контролировать типы пары оснований с помощью номенклатуры Сэнгера (Saenger, 1984) или Леонтиса-Вестхофа (Leontis and Westhof, 2001) и вариантов (Major and Lemieux, 2002), отсюда и различные структурные гипотезы. можно протестировать.Моделирование центра декодирования было разбито на два этапа, чтобы воспользоваться преимуществом принципа «разделяй и властвуй» алгоритма обратного отслеживания MC-Sym (Major 2007; Ali et al. 2010; Wang et al. 2011), в какие более мелкие фрагменты сначала генерируются, а затем используются в качестве входных данных для последующих прогонов моделирования.

На первом этапе нуклеотиды 34–36 петли антикодона тРНК отбираются вместе с нуклеотидом 530 петли 530 рибосомы (). На этом этапе с использованием ограничений расстояния усиливаются две структурные особенности: петля антикодона, петля 530, рибозная застежка-молния и правило Ходжсона и Фуллера для конформации петли антикодона (Fuller and Hodgson 1967).Ограничения по расстоянию для рибозной застежки-молнии составляют (530: N3) — (35: O2 ′) и (530: O2 ′) — (35: O2 ′) от 2,5 до 3,0 Å. Ограничения расстояния для правила Ходжсона и Фуллера: (34: PSY) — (35: PSY) — (36: PSY) — (37: PSY), от 2,5 до 6,0 Å. Укладкой нуклеотидов в петле антикодона можно управлять с помощью ограничения расстояния между последовательными псевдоатомами PSY, которые могут находиться в центре каждого шестичленного кольца каждого нуклеотида.

На втором этапе модели с первого этапа используются в качестве входных данных для MC-Sym, на которые прививаются бессмысленный кодон мРНК и два аденозина Helix 44 ().На этом этапе многие структурные гипотезы могут быть проверены путем явного определения конкретных типов пар оснований между петлей антикодона тРНК и мРНК бессмысленного кодона. Строгий тест A-сайта, выполняемый аденозинами 1492 и 1493 Helix 44 посредством A-минорных взаимодействий с мини-спиралью тРНК-мРНК и G530 Loop 530, воспринимающего положение третьего кодона, налагает структурные ограничения, которые выполняются с помощью ограничений расстояния . Все скрипты MC-Sym доступны по запросу.

При моделировании мы не применяли спаривание G530 / A1492, так как MC-Sym иногда не давал решения, особенно в случае несоответствия A / G во втором положении кодона.A-минорные взаимодействия происходят сами по себе и не требуют соединения A1492 с G530. Кроме того, G530 заблокирован в положении против посредством водородных связей как с сахарными кольцами второго антикодонного нуклеотида тРНК, так и с третьим нуклеотидом кодона.

Минимизация энергии

Все модели были минимизированы по энергии с помощью молекулярного пакета Tinker версии 5 (Ponder and Richards, 1987) и силового поля Amber-99 (Kollman et al. 2000) в газовой фазе.Алгоритм минимизации — это метод Бройдена – Флетчера – Гольдфарба – Шанно (L-BFGS) с ограничением памяти. Сходимость достигается, когда значение среднеквадратичного градиента <0,1 ккал / моль / Å. Катион натрия прикреплен к вершине каждой фосфатной группы, чтобы нейтрализовать общий заряд комплексов. Во время минимизации все тяжелые атомы азотистого основания сохраняются в исходном положении с использованием константы пружины 1001 ккал / моль / Å, в то время как все ионы, протоны, а также основная цепь и атомы сахара могут свободно перемещаться.

Результатами моделирования и минимизации являются наборы ложных целей, каждый из которых имеет свою структурную гипотезу, то есть типы пар оснований. Построив энергетические распределения каждого набора-приманки, мы можем сравнить и ранжировать их по энергетическим предпочтениям. Таким образом, считается, что набор-приманка, который включает 3D-модели с лучшими энергиями, предпочтительно декодируется по сравнению с набором-приманкой, модели которого энергетически менее предпочтительны. Кроме того, сравниваются все энергетические кривые, а не только лучшие энергетические модели, поскольку кривые могут передавать более надежную информацию об энергии, чем одна лучшая энергетическая модель (которая может упасть в глубокую энергетическую скважину, но не представляет надлежащим образом). «ансамбль»).Поскольку функция энергии не идеальна (функциональная форма, параметры и т. Д.), Энтропия отбрасывается, а вычисления энергии выполнялись в контексте неявной модели сольватации, мы не утверждаем, что кривые энергии коррелируют с эффективностью декодирования, но они должны, по крайней мере, обеспечивать качественное ранжирование различных конкурирующих видов тРНК.

Использование модели неявной сольватации мотивировано следующими наблюдениями: во-первых, модели неявной сольватации используют доступную для растворителя площадь поверхности (SASA) для определения среднего вклада воды в определенные атомные группы.Здесь присутствие нескольких явных молекул воды уменьшит SASA для групп атомов, находящихся в прямом контакте с этими явными молекулами воды, тем самым предотвращая двойной учет вклада воды. Во-вторых, замачивание смоделированной системы в явной воде значительно увеличит количество атомов, тем самым компенсируя энергетические различия при мутациях мРНК: тРНК нуклеотидов. Хотя использование явной модели воды могло бы привести к лучшему моделированию динамики взаимодействий мРНК: тРНК: рРНК, это выходит за рамки данной статьи.

Изображенные модели — это модели, которые имеют определенную сеть водородных связей, в частности рибозные молнии для нуклеотидов 530, 1492 и 1493, и соответствующие водородные связи между мРНК и тРНК. Прочность водородных связей рассчитывается, как предложено (Boobbyer et al. 1989), с учетом направленности водородных связей.

Фигуры молекулярной графики были подготовлены с помощью PyMOL.

Информация о правилах присвоения семейств транспортных средств и двигателей

Семейство — это базовая единица, которую EPA использует для идентификации группы транспортных средств или двигателей в целях сертификации и соответствия.

Производитель должен подать заявку на получение новых сертификатов и уплатить соответствующие сборы за сертификацию для каждой фамилии, которую он намеревается производить для продажи в Соединенных Штатах.

Имя семейства — это 12-значный код, который идентифицирует все части этого конкретного двигателя.

Типичное соглашение об именах показано ниже, хотя некоторые секторы имеют небольшие различия.

* Для семейств с двойным или переменным смещением введите максимальное смещение. Если рабочий объем указан в литрах, десятичная точка считается цифрой.Во всех случаях смещение будет считываться в литрах, если указана десятичная точка, и в кубических дюймах или кубических сантиметрах, если десятичная точка отсутствует.

В приведенной ниже таблице найдите код для позиции 1 вашей фамилии.

Этот код представляет собой трехзначный буквенно-цифровой код, который EPA присваивает каждой компании. Используйте этот код для позиций 2–4 вашей фамилии.

Щелкните по своему отраслевому сектору, чтобы просмотреть конкретные инструкции по определению позиций 5–12 вашей фамилии.

Инструкции по поиску / сортировке таблиц

По умолчанию в таблице отображаются все записи таблицы.

Например, чтобы изменить количество записей, показанных на изображении ниже, вы должны щелкнуть стрелку раскрывающегося списка рядом с «Все».

Столбец с синей стрелкой указывает, по какому столбцу сортируется ваша таблица.
Например, если вы видели изображение ниже, таблица будет отсортирована в возрастающем порядке в столбце «Тип технологии».

Чтобы изменить столбец для сортировки таблицы, щелкните стрелку в другом столбце.
Например, если вы хотите отсортировать по убыванию в столбце «Применимо для» на изображении ниже, вы должны щелкнуть стрелку вниз.

Вы можете отфильтровать таблицу с помощью поля поиска. Начните вводить текст в поле поиска, и ваша таблица будет автоматически отображать только строки, содержащие то, что вы ввели в поле поиска.

параметров сортировки таблиц.png

* Сюда также входят автомобили большой грузоподъемности с полной разрешенной массой не более 14000 фунтов, которые не тестируются на шасси-динамометре для сертификации в соответствии с 40 CFR Part 1037 (т. Е. Сертифицированы в соответствии с требованиями и стандартами § 1037.105, согласно § 1037.104 (f )).

Расшифровка белкового состава целых нуклеосом с помощью Nuc-MS

  • 1.

    Моллер, Дж. И де Пабло, Дж. Дж. Снизу вверх встречается сверху вниз: перекресток многомасштабного моделирования хроматина. Biophys. J. 118 , 2057–2065 (2020).

    CAS PubMed Google ученый

  • 2.

    Кампос Э. И. и Рейнберг Д. Гистоны: аннотирующий хроматин. Annu. Преподобный Жене. 43 , 559–599 (2009).

    CAS PubMed Google ученый

  • 3.

    Баннистер, А. Дж. И Кузаридес, Т. Регулирование хроматина модификациями гистонов. Ячейка Res . 21 , 381–395 (2011).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 4.

    Портела А. и Эстеллер М. Эпигенетические модификации и болезни человека. Нат. Biotechnol. 28 , 1057–1068 (2010).

    CAS PubMed Google ученый

  • 5.

    Патель, Д. Дж. И Ван, З. Считывание эпигенетических модификаций. Annu. Rev. Biochem. 82 , 81–118 (2013).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 6. ​​

    Зинк, Л. М. и Хейк, С. Б. Варианты гистонов: функция ядра и болезнь. Curr. Opin. Genet. Dev. 37 , 82–89 (2016).

    CAS PubMed Google ученый

  • 7.

    Рутенбург, А. Дж., Ли, Х., Патель, Д. Дж. И Аллис, К. Д. Многовалентное взаимодействие модификаций хроматина с помощью связанных связывающих модулей. Нат. Rev. Mol. Cell Biol. 8 , 983–994 (2007).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 8.

    Ichikawa, Y. et al. Подход синтетической биологии к исследованию симметрии нуклеосом. eLife 6 , e28836 (2017).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 9.

    Voigt, P. et al. Асимметрично модифицированные нуклеосомы. Cell 151 , 181–193 (2012).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 10.

    Чжэн, Ю., Хуанг, X. и Келлехер, Н. Л. Эпипротеомика: количественный анализ гистоновых меток и кодов с помощью масс-спектрометрии. Curr. Opin. Chem. Биол. 33 , 142–150 (2016).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 11.

    Shah, R. N. et al. Изучение роли состояний метилирования h4K4 с систематически охарактеризованными антителами. Мол. Ячейка 72 , 162–177 (2018).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 12.

    Комптон П. Д., Келлехер Н. Л. и Гунавардена Дж. Оценка распределения состояний посттрансляционной модификации белков с помощью масс-спектрометрии. J. Proteome Res. 17 , 2727–2734 (2018).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 13.

    Белов М.Е. и др. От белковых комплексов к фрагментам основной цепи субъединиц: многоступенчатый подход к нативной масс-спектрометрии. Анал. Chem. 85 , 11163–11173 (2013).

    CAS PubMed Google ученый

  • 14.

    Azegami, N. et al. Неоспоримое доказательство восстановленной гексасомы подтверждено нативной масс-спектрометрией. Биохимия 52 , 5155–5157 ​​(2013).

    CAS PubMed Google ученый

  • 15.

    Lercher, L. et al. Генерация синтетической GlcNAцилированной нуклеосомы выявляет регуляцию стабильности посредством h3A-Thr101 GlcNAcylation. Нат. Commun. 6 , 7978 (2015).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 16.

    Джин, К.и другие. Нуклеосомы, содержащие двойной вариант h4.3 / h3A.Z, маркируют «свободные от нуклеосом области» активных промоторов и других регуляторных областей. Нат. Genet. 41 , 941–945 (2009).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 17.

    Cui, K. et al. Сигнатуры хроматина в мультипотентных гемопоэтических стволовых клетках человека указывают на судьбу двухвалентных генов во время дифференцировки. Cell Stem Cell 4 , 80–93 (2009).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 18.

    Talasz, H., Lindner, H.H., Sarg, B. & Helliger, W. Монометилирование гистона h5-лизина 20 увеличивается в промоторных и кодирующих областях активных генов и коррелирует с гиперацетилированием. J. Biol. Chem. 280 , 38814–38822 (2005).

    CAS PubMed Google ученый

  • 19.

    Svensson, J. P. et al. Карта оборота нуклеосом показывает, что стабильность метилирования гистона h5 Lys20 зависит от рециклинга гистона в транскрибируемом хроматине. Genome Res. 25 , 872–883 (2015).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 20.

    Лулла Р. Р., Сарацис А. М. и Хашизуме Р. Мутации в аппарате хроматина и педиатрическая глиома высокой степени злокачественности. Sci. Adv. 2 , e1501354 (2016).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 21.

    Herz, H.-M. и другие. Мутанты гистона h4, превращающие лизин в метионин, как парадигма для изучения передачи сигналов хроматина. Наука 345 , 1065–1070 (2014).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 22.

    Brumbaugh, J. et al. Индуцируемые мутации гистонов K-to-M являются динамическими инструментами для исследования физиологической роли сайт-специфического метилирования гистонов in vitro и in vivo. Нат. Cell Biol. 21 , 1449–1461 (2019).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 23.

    Piunti, A. et al. Терапевтическое нацеливание белков polycomb и BET bromodomain в диффузных врожденных глиомах моста. Нат. Med. 23 , 493–500 (2017).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 24.

    Taylor, G.CA, Eskeland, R., Hekimoglu-Balkan, B., Pradeepa, M.M. & Bickmore, W.A. Ацетилирование h5K16 маркирует активные гены и энхансеры эмбриональных стволовых клеток, но не изменяет уплотнение хроматина. Genome Res. 23 , 2053–2065 (2013).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 25.

    Nguyen, A. T. & Zhang, Y. Разнообразные функции метилирования Dot1 и h4K79. Genes Dev. 25 , 1345–1358 (2011).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 26.

    Свит, С. М., Ли, М., Томас, П. М., Дурбин, К. Р. и Келлехер, Н. Л. Кинетика восстановления меток метилирования h4K79 в глобальном хроматине человека. J. Biol. Chem. 285 , 32778–32786 (2010).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 27.

    Wang, Y. et al. Варианты гистонов h3A.Z и h4.3 координированно регулируют PRC2-зависимое отложение h4K27me3 и регуляцию экспрессии генов в mES-клетках. BMC Biol. 16 , 107 (2018).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 28.

    Лоу, Б. Р., Максэм, Л. А., Хейми, Дж. Дж., Уилкинс, М. Р. и Партридж, Дж. Ф. Мутации гистона h4: обновленный взгляд на их роль в нарушении регуляции хроматина и раке. Раки 11 , 660 (2019).

    CAS PubMed Central Google ученый

  • 29.

    Тальберт, П. Б. и Хеникофф, С. Варианты гистонов — древние художники обертывания эпигенома. Нат. Rev. Mol. Cell Biol. 11 , 264–275 (2010).

    CAS PubMed Google ученый

  • 30.

    Скин, П. Дж. И Хеникофф, С. Эффективная стратегия целевых нуклеаз для картирования участков связывания ДНК с высоким разрешением. eLife 6 , e21856 (2017).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 31.

    Huang, C. et al. События расщепления тетрамера h4.3-h5 характеризуются энхансерами, специфичными для клеточного типа. PLoS Genet. 9 , e1003558 (2013).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 32.

    Zhao, Z. & Shilatifard, A. Эпигенетические модификации гистонов при раке. Genome Biol. 20 , 245 (2019).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 33.

    Люгер, К., Мадер, А. В., Ричмонд, Р. К., Сарджент, Д. Ф. и Ричмонд, Т. Дж. Кристаллическая структура ядерной частицы нуклеосомы при разрешении 2,8 Å. Nature 389 , 251–260 (1997).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 34.

    Ли, Т. И., Джонстон, С. Э. и Янг, Р. А. Иммунопреципитация хроматина и анализ локализации белков на основе микрочипов. Нат. Protoc. 1 , 729–748 (2006).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 35.

    Vo, B. et al. Инактивация Ezh3 активирует Gfi1 и вызывает агрессивную медуллобластому 3-й группы, управляемую Myc. Cell Rep. 18 , 2907–2917 (2017).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 36.

    Andrews, S. FastQC: инструмент контроля качества для данных последовательности с высокой пропускной способностью. Babraham Bioinformatics http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc (2010).

  • 37.

    Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M. & Salzberg, S.L. Сверхбыстрое и эффективное с точки зрения памяти выравнивание коротких последовательностей ДНК с геномом человека. Genome Biol. 10 , R25 (2009 г.).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 38.

    Zhang, Y. et al. Модельный анализ ChIP-seq (MACS). Genome Biol. 9 , R137 (2008).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 39.

    Heinz, S. et al. Простые комбинации факторов транскрипции, определяющих клонирование, активируют цис- -регуляторных элементов, необходимых для идентичности макрофагов и В-клеток. Мол. Ячейка 38 , 576–589 (2010).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 40.

    Ross-Innes, C. S. et al. Дифференциальное связывание рецептора эстрогена связано с клиническим исходом рака груди. Природа 481 , 389–393 (2012).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 41.

    Yu, G., Wang, L.-G., Han, Y. & He, Q.-Y. clusterProfiler: пакет R для сравнения биологических тем среди генных кластеров. OMICS 16 , 284–287 (2012).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 42.

    Ramírez, F. et al. deepTools2: веб-сервер нового поколения для глубокого анализа данных. Nucleic Acids Res. 44 , W160 – W165 (2016).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 43.

    Эдгар Р., Домрачев М. и Лэш А. Е. Омнибус экспрессии генов: репозиторий данных по экспрессии генов NCBI и гибридизации. Nucleic Acids Res. 30 , 207–210 (2002).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 44.

    Schachner, L. F., Lee, A. & Kelleher, N. L. Протокол для декодирования белкового состава целых нуклеосом с помощью Nuc-MS: подготовка образцов, сбор данных и анализ. Протокол обмена https://doi.org/10.21203/rs.3.pex-1288/v1 (2020).

  • 45.

    Zhang, Z. & Marshall, A.G. Универсальный алгоритм для быстрой и автоматической деконволюции зарядового состояния спектров отношения массы к заряду электроспрея. J. Am. Soc. Масс-спектрометрия. 9 , 225–233 (1998).

    CAS PubMed Google ученый

  • 46.

    Marty, M. T. et al. Байесовская деконволюция масс-спектров и ионной подвижности: от бинарных взаимодействий до полидисперсных ансамблей. Анал. Chem. 87 , 4370–4376 (2015).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 47.

    Fellers, R. T. et al. ProSight Lite: графическое программное обеспечение для анализа данных масс-спектрометрии сверху вниз. Протеомика 15 , 1235–1238 (2015).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 48.

    Форнелли Л.и другие. Точный анализ последовательности моноклональных антител с помощью орбитальной масс-спектрометрии сверху вниз и посередине вниз с применением методов множественной ионной активации. Анал. Chem. 90 , 8421–8429 (2018).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 49.

    Бланд Дж. М. и Альтман Д. Г. Тесты множественной значимости: метод Бонферрони. BMJ 310 , 170 (1995).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 50.

    Kafader, J. O. et al. Мультиплексная масс-спектрометрия индивидуальных ионов улучшает измерение протеоформ и их комплексов. Нат. Методы 17 , 391–394 (2020).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • GR15: край будущего | «Делойт», СНГ

    Edge считается самым экологичным офисным зданием в мире и имеет соответствующий сертификат. Но это еще не все.Место, ну, весело. И интересно. И приглашая. Настолько, что профессионалы фактически подают заявление о приеме на работу в «Делойт Нидерланды», потому что они хотят работать в здании.

    То, что он превратился в инструмент найма, является удовлетворительным побочным эффектом проекта, призванного как переопределить эффективность, так и изменить способ работы людей. «Мы хотели, чтобы наше здание не только соответствовало требованиям устойчивого развития, но и было настоящим инновационным и вдохновляющим местом для наших сотрудников», — говорит генеральный директор Deloitte в Нидерландах Питер Боммель.«Возможность сотрудничества с множеством экспертов обеспечила чувствительность готового здания к окружающей среде и создала технологически продуктивную и счастливую рабочую среду».

    Решение о возведении общественных зданий в Нидерландах не считается случайным. «В Голландии много пустых офисных площадей», — объясняет Тим ​​Слюитер, управляющий недвижимостью подразделения информационных технологий (ИТ) и услуг на рабочем месте, Deloitte, Нидерланды. «Но старые здания менее энергоэффективны, а физическое пространство обычно не соответствует дизайну офиса будущего.Мы хотели продемонстрировать, что новое здание станет образцом устойчивости ».

    Deloitte, Нидерланды, обратился к OVG Real Estate, голландскому девелоперу и инвестору коммерческой недвижимости, чтобы воплотить свое видение в жизнь. «По нашему опыту,« Делойт Нидерланды »стремится к лучшему, и здание, которое мы разработали для них, отражает это, — говорит Коен ван Остром, основатель и генеральный директор OVG. «Мы собрали команду экспертов и поставили перед ними задачу определить инновации, которые сделают Edge одной из самых эффективных коммерческих объектов в мире.”

    Эталон эффективности

    The Edge производит больше электричества, чем потребляет, достижение стало возможным благодаря множеству солнечных панелей, некоторые из которых размещены на соседних зданиях, и подземных накопителях тепловой энергии. Его светодиодная система освещения с питанием от Ethernet на 80 процентов эффективнее обычного освещения. Дождевая вода собирается с крыши и балконов и используется для смыва туалетов в здании и полива садов. Даже контуры конструкции и ее ориентация на солнце играют роль в ее находчивости.

    По завершении строительства в конце 2014 года The Edge получил наивысший балл аккредитации BREEAM для офисного здания — 98,36% — от Building Research Establishment (BRE), глобального эксперта по оценке экологичных зданий.

    Инновационные, подключаемые к сети осветительные панели способны потреблять больше минимального напряжения; они содержат около 28 000 датчиков, которые определяют движение, свет, температуру, влажность и даже уровни углекислого газа. Именно эти датчики, предоставляющие данные в режиме реального времени, делают Edge, возможно, самым умным и удобным для посетителей офисным помещением, используемым сегодня.

    Датчики позволяют менеджерам объекта оценить, как и когда используются определенные части здания. «В нашем здании ИТ и управление помещениями — это совместная функция», — поясняет Слюитер. В краткосрочной перспективе собранную информацию можно использовать для определения того, где уборка проводится вечером, а где нет необходимости. Возникающие в долгосрочной перспективе закономерности, демонстрирующие легкое использование определенных мест в определенные дни, могут привести к тому, что комнаты или даже целые этажи будут закрыты для экономии энергии.

    Подключено и настроено
    Датчики

    также делают Edge интересным и приятным местом для работы.Например, обновления программного обеспечения для приложения для смартфонов, разработанные Deloitte Netherlands, вскоре позволят кофемашинам распознавать людей, когда они подходят и распределяют смеси и надстройки, которые им нужны.

    Приложение уже назначает повседневные рабочие пространства, которые лучше всего соответствуют предпочтениям пользователей, и позволяет им управлять яркостью освещения над своими рабочими поверхностями и регулировать климат в своих конкретных областях. Он может направлять людей по всему зданию, считывая, например, место встречи из онлайн-календаря и предлагая маршрут, чтобы туда добраться.Сотрудники могут даже использовать приложение, чтобы отслеживать свои успехи в тренажерном зале на территории, где некоторые тренажеры фактически подают генерируемую мощность в электрическую сеть здания.

    Здание находится недалеко от остановок общественного транспорта, высокоскоростной железной дороги и сети велосипедных маршрутов. Более 500 парковочных мест для велосипедов побуждают арендаторов ездить на работу педалями. Те, кто должен водить машину, прибывают в высокотехнологичный гараж, который идентифицирует их автомобили, указывает им доступные парковочные места и использует светодиодные фонари, оснащенные датчиками, которые загораются и тускнеют по мере того, как водители прибывают и уезжают.

    Sluiter подчеркивает, что личные данные не могут быть доступны ни менеджерам, ни кому-либо еще. Законы о конфиденциальности гарантируют, что никто не сможет отследить местонахождение человека, узнать, сколько встреч он пропустил, или узнать, в какое время он использует гараж. «Это здание предлагает технологии, позволяющие делать определенные вещи, которые сделают жизнь арендаторов еще проще, и большинство из них с радостью примут эту функциональность», — говорит он. «Но в то же время чрезвычайно важно защищать частную жизнь людей и соблюдать закон.”

    Эти минимальные препятствия, безусловно, не мешают репутации The Edge. «Наша цель заключалась в том, чтобы сделать Edge лучшим местом для работы», — говорит Эрик Убельс, директор отдела ИТ и услуг на рабочем месте, Deloitte, Нидерланды. «Наши конференц-залы заполняются, потому что каждый клиент и сотрудник хочет познакомиться с этим зданием. Он еще не маленький, но экономика растет, и в здании становится много людей. Возможно, мы сделали его слишком популярным ».

    Повышение устойчивости в сети

    Edge, несомненно, является самым «зеленым» из офисов компаний-членов DTTL и Deloitte по всему миру, но другие помещения Deloitte получили сертификаты BREEAM или LEED (лидерство в области энергетики и экологического дизайна).Университет Делойта в США сертифицирован по системе LEED, как и офисные помещения, занимаемые DTTL и американской фирмой в Рокфеллер-центре, 30 в Нью-Йорке. Многие офисные помещения других фирм-членов в США и за рубежом, включая Гонконг, Стамбул и Сан-Паулу, имеют сертификат LEED. Офис в Цюрихе получил награду LEED Platinum, а несколько офисных помещений Deloitte в Великобритании получили сертификацию BREEAM.

    Путешествия и офисные потребности глобальной сети предприятий являются основными факторами воздействия Deloitte на окружающую среду в целом.Воздействие транспорта на окружающую среду, особенно авиаперелетов, представляет собой сложную проблему, которую необходимо будет решить при глобальном сотрудничестве и приветствуемом диалоге. Хотя абсолютные выбросы парниковых газов (ПГ) Deloitte увеличились на 2 процента по сравнению с 2014 финансовым годом, численность персонала Deloitte также выросла на 7 процентов. Таким образом, интенсивность выбросов парниковых газов в пересчете на полный рабочий день (метрические тонны CO2-экв. / FTE) снизилась на 6 процентов. Аналогичным образом, интенсивность выбросов парниковых газов по выручке (кг CO2-экв. / Тыс. Долларов США выручки) снизилась на 1 процент по сравнению с прошлым годом.

    «Еще одна наша цель — сократить количество потребляемых ресурсов первичной бумаги», — говорит Дэвид Пирсон, директор по устойчивому развитию Deloitte Global. «В 2015 финансовом году Deloitte добилась этого, сократив количество используемой нами бумаги на 11 процентов и выбрав больше бумаги с содержанием вторичного сырья, что увеличило процент используемых вторичных материалов более чем на 30 процентов по сравнению с 2014 финансовым годом».

    За последние пять лет численность персонала «Делойта» во всем мире увеличилась на 24 процента. За тот же период наши меры по повышению экологической эффективности улучшились, о чем свидетельствует снижение на 14 процентов интенсивности выбросов парниковых газов в расчете на один рабочий день, сокращение выбросов на 22 процента на доллар выручки и сокращение общего использования бумаги на 25 процентов.«Мы надеемся развить эту динамику», — говорит Пирсон.

    Расшифровка вселенной РНК-структур и транс-РНК-РНК-взаимодействий транскриптомов in vivo: от экспериментальных протоколов к компьютерному анализу

    Структурными строительными блоками вторичных структур РНК и взаимодействий транс-РНК-РНК являются пары оснований. Тем не менее, ни один из транскриптомных методов химического зондирования структур РНК in vivo, описанных выше, не сохраняет прямую информацию о парах оснований .Скорее, информация о зондировании структуры РНК линеаризуется и кодируется в отдельных положениях последовательности . Любая прямая информация о соответствующих партнерах по сопряжению теряется. Это основная причина, по которой требуются большие вычислительные усилия для преобразования необработанных экспериментальных данных, специфичных для позиции, обратно в реальные структуры РНК, включающие пары оснований.

    4.1 Экспериментальные протоколы PARIS, SPLASH и LIGR-seq

    Все три новых метода, например, PARIS (Lu et al., 2016), SPLASH (Aw et al.2016) и LIGR-seq (Sharma et al. 2016), непосредственно исследуют так называемые дуплексы, то есть участки более или менее последовательных пар оснований. Каждый дуплекс может включать одну и ту же или две разные РНК и, таким образом, соответствовать либо структурной характеристике РНК, либо взаимодействию транс, РНК-РНК. Важно отметить, что все три экспериментальных протокола обрабатывают оба типа дуплексов идентичным образом (и что их соответствующие конвейеры вычислительного анализа должны обнаруживать и различать оба случая).Таким образом, все три метода являются методами как прямого зондирования структуры РНК, так и прямого зондирования взаимодействий транс и РНК-РНК. Концептуально все три протокола имеют общие шаги, но отличаются важными деталями. Их общая логическая последовательность такова, см. Также рис. 1.

    4.1.1 Экспериментальный протокол PARIS

    На первом этапе PARIS дуплексы, соответствующие особенностям структуры РНК или взаимодействиям РНК-РНК транс, , ковалентно перекрещиваются. -связанные с использованием производного псоралена 4′-аминометилтриоксалена (AMT) и УФ-света при 365 нм.Для этого AMT интеркалирует между парами оснований и ковалентно сшивает преимущественно соседние пиримидины (Calvet and Pederson 1979; Cimino et al. 1985). Это эффективно скрепляет вместе два ответвления пары оснований, участвующих в каждом дуплексе. На втором этапе переваривание РНКазой S1 используется для удаления одноцепочечных областей РНК. Впоследствии ShortCut RNase III используется для уменьшения размера дуплексов и полного расщепления протеиназой, а очистка РНК дает короткие дуплексы с прямым спариванием оснований.На третьем этапе для очистки и обогащения используется 2D-электрофорез, поскольку сшитые дуплексы выглядят недиагональными, что соответствует 0,2% –0,5% РНК, используемой в качестве входных данных для 2D-электрофореза. Этот шаг может снизить общую чувствительность. На четвертом этапе концы этих выбранных дуплексов лигируются на близком расстоянии перед обратным сшиванием дуплексов с использованием УФ-света при 254 нм. Эффективность перекрестного лигирования является ключевым фактором для гарантии того, что информация о плечах спаривания оснований, участвующих в одном дуплексе, не теряется.Этап лигирования объединяет два плеча, участвующих в одном дуплексе, в искусственную РНК, в которой линейное упорядочение двух ветвей априори неясно. Наконец, к 3 ’концам добавляются пре-аденилированные адаптеры, полученные РНК подвергаются обратной транскрипции адаптер-специфическим способом, генерируются кольцевые кДНК и выполняется ПЦР-амплификация для создания библиотек кДНК для NGS.

    PARIS был первоначально выполнен на клетках HeLa, HEK293T и эмбриональных стволовых клетках мыши (mES). Лу и др.проведите контрольные эксперименты -AMT и не наблюдайте никаких обнаруживаемых недиагональных элементов в соответствующем 2D-электрофорезе.

    4.1.2 Экспериментальный протокол SPLASH

    Общий логический поток SPLASH аналогичен PARIS. В отличие от PARIS, поперечное сшивание дуплексов на первом этапе осуществляется с использованием биотинилированной версии псоралена (так называемого биопсоралена) также с использованием УФ-света при 365 нм. Группа биотина является ключевой для последующего этапа обогащения. Подобно AMT, биопсорален также предпочитает сшивающие пиримидины (Garrett-Wheeler et al.1984; Херст 1981). Однако, в отличие от AMT, биопсорален обычно требует добавления мягкого детергента (например, дигитонина) для значительного увеличения клеточного поглощения. Детали этого (то есть концентрации и продолжительность лечения биопсораленом и дигитонином) должны быть тщательно отрегулированы для каждого типа клеток отдельно. На втором этапе сшитые дуплексы извлекаются, случайным образом фрагментируются с использованием гидролиза, опосредованного Mg 2+ , и обогащаются биотином с использованием магнитных гранул стрептавидина.Обратите внимание, что из-за случайного характера процедуры фрагментации в гибридизированной области может возникнуть разрыв. Следовательно, есть вероятность, что обнаруженная длина дуплекса не соответствует полной длине исходного дуплекса. Таким образом, стадия обогащения SPLASH экспериментально более эффективна и концептуально более прямолинейна, чем стадия обогащения PARIS, включающая более свободно определенную недиагональ в 2D-электрофорезе. На третьем этапе концы образующихся дуплексов лигируют перед использованием УФ-света с длиной волны 254 нм, как в PARIS, для обратного сшивания.Как и в случае с PARIS, четвертый этап включает добавление преаденилированных адаптеров на 3 ’концах, обратную транскрипцию полученных РНК адаптор-специфическим способом и создание кольцевых кДНК. Опять же, амплификация ПЦР выполняется для получения окончательной библиотеки кДНК для NGS.

    Протокол SPLASH использовался для исследования клеток HeLa, лимфобластоидных клеток человека, эмбриональных стволовых клеток человека (hES), клеток, дифференцированных с использованием ретиноевой кислоты, и двух типов клеток из S.cerevisiae , а именно клетки дикого типа и мутантные клетки геликазы Prp43. Используя от двух до четырех биологических повторов для каждого типа клеток, они измеряют высокую корреляцию (R = 0,75–0,9). Aw et al. (2016) генерируют несколько контрольных библиотек без перекрестного связывания и без лигирования, чтобы подтвердить, что дуплексы, идентифицированные SPLASH, действительно обогащены для лигированных, перекрестно-связанных случаев, а не из-за случайных фоновых событий. Кроме того, они явно подтверждают, что перекрестное связывание с использованием биопсоралена в значительной степени не зависит от доступности растворителя, и показывают, что SPLASH может обнаруживать особенности структуры РНК с такой же точностью, что и подход, основанный на лигировании близости, Ramani et al.(2015) и имеет еще более высокую чувствительность в отношении взаимодействий транс и РНК-РНК.

    4.1.3 Экспериментальный протокол LIGR-seq

    Концептуально LIGR-seq преследует те же цели, что и PARIS и SPLASH, а именно прямое обнаружение дуплексов, образованных с помощью структурных особенностей РНК или посредством взаимодействий РНК-РНК trans . В отличие от этих двух протоколов, он использует несколько функций, которые четко различают его и оказывают значительное влияние на последующую вычислительную интерпретацию необработанных считываний.

    Подобно PARIS, первый этап LIGR-seq состоит из in vivo сшивания дуплексов с использованием AMT и УФ-света при 365 нм. Таким образом, с точки зрения специфичности образующихся поперечно-сшитых дуплексов LIGR-seq сравним с PARIS (AMT) и SPLASH (биопсорален). На втором этапе РНК извлекается из клеток и подвергается ограниченному перевариванию с применением одноцепочечной эндонуклеазы S1. На третьем этапе используется лигаза circRNA для связывания близких концов РНК. Четвертая стадия — стадия обогащения, на которой используется РНКаза R (экзорибонуклеаза от 3’-к’-5 ’) для расщепления линейных и структурированных РНК, дуплексы которых не были сшиты (Vincent and Deutscher 2006).Пул выживших РНК состоит из полностью кольцевых РНК и линейных РНК с поперечно-сшитыми дуплексами (а также линейных РНК с несшитыми дуплексами, 3’-концы которых слишком короткие, чтобы РНКаза R могла зацепиться за них). Некоторые ложноположительные результаты вполне могут пережить лечение РНКазой R. На пятом этапе происходит обратное сшивание дуплексов с использованием УФ-света при 254 нм. Наконец, полученные РНК (так называемые химеры в статье LIGR-seq) используются для подготовки однонитевых библиотек для NGS. В отличие от PARIS и SPLASH, экспериментальный протокол LIGR-seq по умолчанию включает приготовление образца -AMT без какого-либо AMT-индуцированного перекрестного связывания.Все образцы концептуально являются ключевыми для последующей вычислительной интерпретации необработанных данных LIGR-seq. Без них было бы концептуально невозможно определить специальную вероятностную модель, которая могла бы присвоить оценочные значения p экспериментально обнаруженным взаимодействиям. Из трех методов LIGR-seq в настоящее время является единственным методом, который пытается экспериментально оценить значения значимости для его обнаруженных взаимодействий. Как мы увидим в следующем обсуждении конвейеров вычислительного анализа, также возможно присвоить значения значимости или p -значения предлагаемым характеристикам структуры РНК на основе чисто теоретических соображений, но они концептуально отличаются от p — значения, полученные с помощью LIGR-seq.

    4.1.4 Сводка всех трех экспериментальных протоколов

    После NGS необработанные данные из PARIS, SPLASH и LIGR-seq соответствуют считываниям, каждое из которых кодирует последовательность двух плеч, участвующих в ранее сшитом дуплексе. Одно из ключевых различий в отношении методов исследования химической структуры РНК заключается в том, что любой дуплекс можно исследовать только один раз, так как молекулы самого дуплекса в конечном итоге исследуются протоколом. В отличие от этого, методы химической структуры РНК могут исследовать любой отдельный транскрипт несколько раз и в разные моменты времени, поскольку они не потребляют исследуемую молекулу.

    Для любого данного дуплекса, полученного с помощью PARIS, SPLASH или LIGR-seq, неясно, происходит ли соответствующий дуплекс от интер- или от внутримолекулярного дуплекса , то есть от взаимодействия РНК-РНК транс или от Особенности строения РНК. Также неясно, в каком линейном порядке два плеча, участвующие в соответствующем дуплексе, появляются в результирующей РНК и где находится их граница. Это ключевые проблемы, которые необходимо решить при последующем вычислительном анализе необработанных данных.

    Все три экспериментальных протокола включают сшивающий аппарат (например, AMT (PARIS и LIGR-seq) или биопсорален (SPLASH)), который имеет значительный уклон в сторону интеркалирования и перекрестного связывания пиримидинов (Calvet and Pederson 1979; Cimino et al. 1985). Таким образом, совершенно обычные дуплексы, такие как дуплексы, включающие только пары оснований G – C, могут вообще не обнаруживаться с помощью PARIS, SPLASH и LIGR-seq. Любое отсутствие детектируемых дуплексов, следовательно, не обязательно может быть принято как экспериментальное доказательство того, что соответствующая особенность структуры РНК для взаимодействий trans РНК-РНК не существует.

    Кроме того, все три экспериментальных протокола включают множество шагов, каждый из которых вносит определенные ошибки и смещения, которые складываются. Как мы увидим ниже, на общую чувствительность и специфичность комбинированного шага каждого экспериментального протокола дополнительно влияют ошибки и смещения, вносимые вычислительным анализом необработанных экспериментальных данных. Таким образом, имеет смысл рассматривать и, в идеале, оптимизировать и то, и другое параллельно.

    4.2 Вычислительные протоколы PARIS, SPLASH и LIGR-seq

    Основными задачами вычислительного анализа необработанных данных из PARIS, SPLASH и LIGR-seq являются (1) отображение секвенированных считываний обратно в соответствующий геном / транскриптом. и (2) выяснять для каждого считывания, соответствует ли оно интермолекулярному дуплексу или внутримолекулярному дуплексу.По идее, обе задачи должны решаться одновременно, что составляет ключевую задачу анализа этих экспериментальных данных in silico. В отличие от секвенированных считываний, полученных в экспериментах по зондированию химической структуры РНК, необработанные данные, полученные с помощью PARIS, SPLASH и LIGR-seq , не соответствуют последовательной подпоследовательности какого-либо отдельного транскрипта . Скорее, каждое чтение либо кодирует два отдельных дуплекса в одном и том же транскрипте (если дуплекс соответствует признаку структуры РНК) или дуплекс, включающий два транскрипта (если дуплекс соответствует взаимодействию trans РНК-РНК).

    В случае дуплекса структуры РНК, отображение соответствующего считывания требует выравнивания с пробелами в один транскрипт (с пробелом, вставленным между двумя спаренными основаниями дуплекса, кодируемого при чтении) или химерного выравнивания в случае две части неканоничны из-за образования круга. Это усложняется тем фактом, что линейный порядок рук при чтении не обязательно должен соответствовать естественному линейному порядку двух рук в лежащей в основе транскрипции (так называемые хиастические чтения).В случае дуплекса trans РНК-РНК, картирование считывания включает идентификацию пары транскриптов, к которой на карте считывания относится одно из двух спаренных оснований. Это концептуально и вычислительно сложно, поскольку пространство поиска всех пар транскриптов огромно по сравнению с пространством поиска отдельных транскриптов. Также здесь линейный порядок, в котором две руки появляются при чтении, не обязательно должен соответствовать порядку, в котором появляются соответствующие две транскрипции (хиастические чтения).Кроме того, для обоих типов дуплексов граница между двумя плечами, то есть место, где должен быть вставлен зазор для отображения, априори не известна. Еще больше усложняет ситуацию то, что вычислительный анализ должен определить для каждого считывания, соответствует ли оно дуплексу РНК-структуры или дуплексу trans РНК-РНК.

    Анализ расчетных данных, опубликованный совместно с экспериментальными протоколами PARIS, SPLASH и LIGR-seq, имеет некоторые общие черты, но различается в ключевых деталях.Поскольку эти различия связаны не только с различиями в экспериментальных протоколах, но отчасти с различными базовыми стратегиями интерпретации необработанных данных, мы обсудим их здесь.

    4.2.1 Вычислительный анализ исходных данных PARIS

    Необработанные считывания PARIS сначала предварительно обрабатываются путем удаления адаптеров с 3 ’концов и дубликатов ПЦР. Последнее возможно благодаря вставке штрих-кода (случайный гексамер) в середину адаптера. Затем эти считывания сопоставляются с соответствующим геномом с помощью компьютерной программы STAR (Dobin et al.2013) с набором входных параметров, которые явно разрешают чтение с пробелами, а также так называемое хиастическое чтение.

    При хиастическом чтении необходимо инвертировать линейный порядок отображаемых частей (в нашем случае, двух плеч дуплекса). Итак, чтение, кодирующее дуплекс 5′-RL-3 ‘с правым (R) и левым (L) плечами дуплекса структуры РНК, должно отображаться как 5′-L-3′-gap-5’-R. -3 ‘к исходному транскрипту. Эти хиастические чтения естественно возникают во всех протоколах всякий раз, когда лигирование сшитого дуплекса, полученного из структуры РНК, приводит к слиянию двух плеч спаривания оснований дуплекса в неправильном линейном порядке, т.е.е. 5’-R-L-3 ’, а не 5’-L-R-3’. Хиастические чтения могут также возникать в дуплексах, соответствующих взаимодействиям транс, РНК-РНК всякий раз, когда отображение считывания 5′-RL-3 ‘с (линейно упорядоченными) транскриптами транскриптома требует обратного линейного упорядочения двух плеч участвует в дуплексе. Таким образом, правильное отображение хиастических чтений всегда подразумевает вставку пробела.

    Прежде чем сопоставление с STAR может быть выполнено, необходимо сгенерировать соответствующий индекс STAR.Это необходимо сделать с помощью тщательно отрегулированного параметра для genomeSAindexNbases всякий раз, когда создается индекс для так называемого мини-генома. Авторы PARIS используют эти мини-геномы, чтобы искусственно уменьшить пространство поиска для картирования, в частности, при поиске конкретных взаимодействий РНК-РНК trans , а также при исследовании выбранных генов с точки зрения особенностей структуры РНК (например, ген Xist или только подмножество мяРНК). Параметры STAR должны быть явно настроены всякий раз, когда используются мини-геномы.

    Из всех результирующих считываний PARIS с отображением STAR сохраняются только пропущенные и хиастические. Из пропущенных чтений сохраняются только те, пропуск которых не связан со сплайсингом.

    На следующем этапе сохраненные отображенные чтения группируются в так называемые дуплексные группы (DG). Это делается с помощью жадного алгоритма, состоящего из двух шагов. На первом этапе сопоставленные чтения группируются в начальные DG, так что все чтения в DG имеют общее перекрытие не менее 5 нт в обоих дуплексных плечах (эти две области перекрытия определяют так называемые основные области DG).Таким образом, любое отображаемое чтение либо объединяется с уже существующим DG, либо используется для запуска нового DG. На втором этапе ГД объединяются в единые ГД, если они расположены близко друг к другу и «четко определены» для обоих ответвлений, подробности см. В дополнительной информации ПАРИЖ (Лу и др., 2016).

    После создания групп DG каждой дуплексной группе DG назначается так называемая оценка соединения, которая определяется как \ (cs (DG) = N _ {\ mathrm {span}} (DG) / \ sqrt {N_ {\ mathrm {left}} (DG) \ cdot N _ {\ mathrm {right}} (DG)} \), где N span ( DG ) — это количество считываний, охватывающих два дуплексных плеча DG и N слева ( DG ) и N справа ( DG ) — это количество уникальных считываний, перекрывающих левое и правое плечо DG , соответственно.Обратите внимание, что N слева ( DG ) может отличаться от N справа ( DG ), поскольку считывания, охватывающие каждое плечо DG , также могут быть назначены другим дуплексным группам, перекрывающим DG только в одной руке. Любая дуплексная группа DG с оценкой соединения cs ( DG ) <0,01 затем отбрасывается, чтобы сосредоточить последующий анализ на дуплексах, которые поддерживаются значительной частью перекрывающихся считываний транскриптов.

    Получающиеся дуплексы обычно включают два плеча по 20–30 н. Однако конкретные пары оснований, участвующие в дуплексе между этими двумя плечами, не могут быть непосредственно выведены из любой DG. Скорее, они должны быть предсказаны на основе оружия Генерального директора.

    Lu et al. (2016) обнаружили, что известные взаимодействия miRNA-mRNA не могут быть обнаружены либо потому, что дуплекс, участвующий в затравочной области, довольно короткий (около 5 нуклеотидов в длину), и / или потому, что связывание дуплекса с белком Argonaute защищает дуплекс от перекрестного воздействия. связывание.

    Lu et al. попытайтесь присвоить статистическую значимость каждому обнаруженному дуплексу (соответствует ли структурная особенность РНК или взаимодействию trans РНК-РНК). Для этого они сравнивают свободную энергию структуры MFE, предсказанную для множественного выравнивания последовательностей, лежащего в основе этого DG, с соответствующими предсказанными свободными энергиями для 100 рандомизированных версий этого множественного выравнивания последовательностей. Таким образом, они получают Z-оценку (Gesell and von Haeseler 2006). Однако при использовании процедуры, которая фокусируется только на выравнивании множественных последовательностей, лежащих в основе DG, Z-оценка не может оценить статистическую значимость случайного наблюдения этого DG в одном и том же транскрипте, не говоря уже о целом транскриптоме, что было бы в идеале хотелось бы знать.Лу и др. оцените общую производительность PARIS, исследуя выбранные РНК (рРНК, мяРНК, микроРНК, теломеразную РНК). Это делается путем визуального сравнения соответствующих DG с известными функциями.

    4.2.2 Вычислительный анализ исходных данных SPLASH

    Концептуально общий логический процесс вычислительного анализа SPLASH аналогичен описанному выше для PARIS. Однако ключевые детали различаются, и они оказываются важными.

    Для начала транскриптомы для целей картирования генерируются путем загрузки соответствующих эталонных транскриптомов (принимая самую длинную известную изоформу для каждого кодирующего или некодирующего гена в качестве репрезентативного транскрипта) и вручную добавляя выбранные классы некодирующих генов.Затем удаляются любые дубликаты последовательностей из набора соединений.

    На первом этапе необработанные считывания с парного конца SPLASH предварительно обрабатываются путем удаления адаптеров и объединения перекрывающихся считываний с парного конца в соответствующие отдельные считывания. На следующем этапе только эти единичные объединенные чтения сохраняются и отображаются на соответствующий эталонный транскриптом с использованием BWA MEM (версия 0.7.12) (Li and Durbin, 2010) с использованием параметра -T 20 для снижения минимальной длины отображаемых областей до 20 нт. . Эти сопоставленные чтения затем обрабатываются путем их сортировки и преобразования в формат BAM с помощью samtools.Затем чтения фильтруются на предмет потенциальных дубликатов ПЦР путем изучения наборов считываний с идентичными начальными координатами и идентичными строками CIGAR и путем сохранения только первого чтения в каждом таком наборе (Ramani et al. 2015).

    В первоначальном анализе SPLASH авторы решили сознательно сосредоточить весь свой последующий анализ на дальнодействующих характеристиках, то есть особенностях структуры РНК и взаимодействиях транс и РНК-РНК, где два плеча, участвующие в соответствующем дуплексе, далеки друг от друга. основного пространства поиска.Технически это достигается за счет сохранения только разделенных выравниваний более чем на 50 нт, кроме BAM-файла отображенных чтений. Затем авторы SPLASH применяют несколько мер для повышения качества сохраняемых отображенных операций чтения. Считывания с качеством отображения ниже 20 отбрасываются. Кроме того, неоднозначно отображенные чтения и отображенные чтения с одинаково оцененными вторыми лучшими совпадениями отбрасываются (например, псевдогены). Чтобы снизить количество ложных срабатываний, любое считывание, охватывающее известный сплайс-соединение, удаляется с помощью STAR (Dobin et al.2013), чтобы отобразить расщепленные чтения из транскриптома обратно в соответствующий геном. Для этого предполагается, что эталонные наборы известных стыковых соединений являются правильными и полными.

    Указанная общая чувствительность SPLASH в 78% основана на его характеристиках для известных особенностей структуры РНК 80S рибосомы. Сообщается, что общая точность составляет 75%. Чтобы оценить частоту ложного обнаружения, независимо сшитые тотальные РНК из человеческих дрожжей были объединены для подготовки и анализа библиотек SPLASH на предмет любых взаимодействий между человеком и дрожжами.Согласно этой стратегии, SPLASH имеет коэффициент ложного обнаружения <3,7%.

    Чтобы присвоить статистическую значимость или значение p взаимодействиям, обнаруженным SPLASH, свободная энергия парного взаимодействия в обнаруженном дуплексе сравнивается со свободной энергией многих перемешанных рандомизированных версий последовательностей, лежащих в основе той же последовательности. попарное взаимодействие. Процедура рандомизации сохраняет содержание динуклеотидов. Таким образом, SPLASH использует ту же стратегию, что и PARIS, для оценки значений p для обнаруженных взаимодействий (в PARIS это делается путем перетасовки множественных выравниваний последовательностей; в SPLASH это делается путем рандомизации только последовательностей, участвующих в дуплексе).Обе процедуры основаны на достоверности предположения, что истинные взаимодействия in vivo имеют более низкую минимальную свободную энергию, чем взаимодействия между соответствующими рандомизированными версиями тех же последовательностей. Однако это предположение, как правило, не оправдано (Rivas and Eddy 2000). В любом случае, результирующее значение p нельзя интерпретировать как вероятность случайного наблюдения соответствующего дуплекса структуры РНК или особенности взаимодействия trans РНК-РНК. Для этого необходимо исследовать полные транскрипты (в случае особенностей структуры РНК) или пары транскриптов (в случае взаимодействия транс, РНК-РНК).

    Это может быть достигнуто, например, с помощью Transat (Wiebe and Meyer 2010), полностью вероятностного метода, который принимает в качестве входных данных выравнивание нескольких последовательностей и соответствующее дерево эволюции и обнаруживает эволюционно консервативные дуплексы (так называемые спирали) в входное выравнивание. Любым предсказанным спиралям присваивается оценка логарифма правдоподобия, а также значение p . Это значение p соответствует возможности случайного наблюдения дуплекса в той же расшифровке.

    4.2.3. Вычислительный анализ необработанных данных LIGR-seq

    Необработанные данные LIGR-seq состоят из одноцепочечных считываний с одной стороны. Подобно описанным выше процедурам для PARIS и SPLASH, эти необработанные считывания сначала необходимо подвергнуть вычислительной постобработке, прежде чем можно будет начать их фактическую интерпретацию с точки зрения биологического содержания.

    Для этого LIGR-seq предлагает специальный конвейер вычислительного анализа, называемый aligater, состоящий из нескольких шагов. В отличие от PARIS и SPLASH, конвейер содержит специальную вероятностную модель, которая используется для оценки значений p для обнаруженных взаимодействий.На первом этапе удаляются случайные штрих-коды с 5-дюймовых концов. На втором этапе эти обрезанные считывания сопоставляются с соответствующим транскриптомом с использованием bowtie2 с набором специально настроенных входных параметров, которые направлены на максимизацию чувствительности при сохранении разумной вычислительной продолжительности анализа. На третьем этапе эти начальные выравнивания bowtie2 в формате BAM повторно анализируются, так что блоки для каждого считывания рекурсивно объединяются в более длинные выравнивания для обнаружения химер.Эта процедура также может обрабатывать продукты круговой перевязки и определяет лучший путь для чтения. На этом этапе каждому связанному выравниванию присваивается балл, и он концептуально является ключевым для всего последующего анализа. Ключевой соответствующий входной параметр для этой процедуры (так называемый штраф за цепочку) должен быть тщательно отрегулирован в зависимости от качества библиотеки, а также характеристик конкретного класса исследуемых транскриптов. Затем считываниям с наилучшими показателями цепных выравниваний присваивается индивидуальная оценка LIGQ, в которой сохраняется подробная информация о соответствующих выравниваниях.

    Эти оценки LIGQ впоследствии используются для тщательного решения нескольких потенциальных проблем путем отбрасывания или переклассификации химер. Например, артефакты из-за неправильного картирования сплайсированного транскрипта и почти идентичных дубликатов последовательностей (из-за повторов, псевдогенов или паралогов) идентифицируются через почти идентичные совпадения с непрерывными участками основного генома, перекрывающими сайт лигирования, и отбрасываются. . Другие артефакты, которые неправильно идентифицируют внутримолекулярные взаимодействия как межмолекулярные , переклассифицированы на основании соответствующих подтверждающих данных.В целом выполняется пять различных шагов постобработки, в результате чего получается стратегия, которая переклассифицирует события, а не просто отбрасывает их, и нацелена на высокую чувствительность.

    Еще одно существенное концептуальное отличие LIGR-seq от двух других протоколов, то есть SPLASH и PARIS, заключается в том, что он предлагает экспериментальную стратегию для оценки статистической значимости обнаруженных дуплексов. Это достигается с помощью специальной вероятностной модели, которая оценивает наблюдаемые и ожидаемые отношения химерных считываний.Каждое наблюдаемое отношение к ожидаемому (т.е. OE + AMT или OE -AMT ) соответствует соответствующим экспериментам (т.е. + AMT или -AMT) с лигазой и без нее. Для этого проводят отдельные контрольные эксперименты + AMT и -AMT без этапа лигирования, чтобы оценить ожидаемые фоновые уровни ложных событий лигирования. Полученные в результате чтения LIGR-seq затем вычислительно обрабатываются, как описано выше, для обнаружения событий взаимодействия (химер). Любой паре генов g x и g y присваивается вероятность ложных транс-взаимодействий P B ( g x , g y ) (с использованием нижнего индекса B для фона), который, как предполагается, является только функцией соответствующей относительной общей численности гена P ( g x ) гена g x и P ( g y ) гена g y соответственно.Математически это соответствует вероятности двух независимых ничьих из полиномиального распределения, которая пропорциональна относительной численности каждого гена в транскриптоме. Это определяет их так называемую нулевую модель.

    Относительная численность всего гена для каждого гена г измеряется в единицах считывания на миллион без корректировки длины (обработка РНКазой R предотвращает эту нормализацию) и обозначается об / мин ( г ). Итак, P B ( г x , г y ) ∝ P ( г x ) P ( г y ) если x y и если g x и g y имеют экспериментально подтвержденные события взаимодействия.Напротив, P B ( g x , g y ) = 0, если x = y или если x y и никаких взаимодействий между этими двумя генами не обнаружено. Нормализованная вероятность ложных взаимодействий между геном g x и g y , p B ( g x , g y ) затем записывается как (с использованием P ( г j ) = об / мин ( г j ) ∕ ∑ i об / мин ( г i )):

    $$ \ displaystyle \ begin {align} \ begin {array} {rcl} p_B (g_x, g_y) & \ displaystyle = & \ displaystyle \ frac {P_B (g_x, g_y)} {\ sum_i \ sum_j P_B (g_i, g_j)} \\ & \ displaystyle = & \ displaystyle \ frac {{\ mathrm {RPM}} (g_x) {\ mathrm {RPM}} (g_y)} {\ sum_i \ sum_ {j \, \ mathrm {with} \, j \ neq i} {\ mathrm {RPM}} (g_i) {\ mathrm {RPM}} (g_j)} \ end {array} \ end {align} $$

    Эта нулевая модель предполагает что вероятность прямого ложного взаимодействия trans РНК-РНК между t Два гена g x и g y в транскриптоме являются только функцией относительного обилия полного гена для каждого гена в транскриптоме.Эта модель не отражает идентичность первичной последовательности каждого гена, которая, вероятно, также влияет на вероятность ложных взаимодействий РНК-РНК trans . Предполагая валидность их нулевой модели, каждому экспериментально обнаруженному взаимодействию между генами g x и g y можно затем присвоить значение p на основе количества наблюдаемых прочтений k , которые его поддерживают. Это позволяет явно фильтровать важные взаимодействия, вызванные AMT.Технически это достигается путем определения сначала показателя обогащения r AMT , который определяется как соотношение между OE + AMT и OE −AMT , то есть r AMT = OE + AMT ∕ ОЕ −AMT . Для реальных AMT-индуцированных взаимодействий мы ожидаем OE + AMT > OE AMT и требует r AMT > 1,1, более 2 чтений ( k > 2), a p -значение < α и поддерживаемое число оборотов более 10.Точно так же взаимодействия с r AMT <0,9 (и более 2 считываний ( k > 2), значение p < α и частота вращения более 10) считаются ложными срабатываниями и допускают чтобы явно оценить частоту ложных срабатываний всего протокола. Кроме того, LIGR-seq использует две биологические копии. Это позволяет оценить общую техническую воспроизводимость протокола (Spearman Rho = 0,38, p <8 ⋅ 10 −6 ).

    В целом, уровень ложного обнаружения LIGR-seq оценивается в диапазоне от 4,4% для высоко экспрессируемых транскриптов (> 250 об / мин) до 25% для редко экспрессируемых транскриптов (> 10 об / мин). Эти числа можно рассматривать как оценки наихудшего случая, поскольку некоторые известные стабильные взаимодействия могут быть обнаружены как в образцах + AMT, так и -AMT. Высокая чувствительность LIGR-seq может быть явно подтверждена на основе известных взаимодействий в выбранных группах генов, например. известные особенности структуры РНК в рибосоме 80S (Anger et al.2013) и транс РНК-РНК взаимодействий между 28S и 5S рРНК.

    В целом, LIGR-seq — единственный из трех протоколов для измерения структурных особенностей РНК и взаимодействий trans РНК-РНК in vivo, который пытается присвоить экспериментально оцененные значения значимости обнаруженным характеристикам. Это делается путем предложения явной нулевой модели и использования специальных экспериментально определенных контрольных образцов. Как упоминалось выше, Transat (Wiebe and Meyer 2010) может быть легко использован для присвоения значений p любым экспериментально определенным дуплексам, чтобы оценить их статистическую значимость с точки зрения вероятности случайного наблюдения каждого дуплекса в исходном транскрипте.

    инвестиций в разведку и добычу. Буровые работы и рынки, геофизика и морское строительство (2019)

    После небольшого подъема, начавшегося в 2017 году после двух лет значительного спада, в 2019 году глобальные инвестиции в разведку и добычу (разведка и добыча) снова упали, снизившись на 1% по сравнению с 2018 годом, согласно данным к данным, предоставленным Rystad Energy. С учетом того, что затраты на строительство месторождений нефти, измеряемые индексом затрат на строительство разведки и добычи (UCCI) IHS, также увеличились на 1,2% за тот же период, снижение на основе постоянных затрат превысило 2%.Глобальные инвестиции в разведку и добычу оцениваются в 540 миллиардов долларов в 2019 году, то есть на 5 миллиардов долларов меньше, чем в 2018 году, и на 40% ниже рекордного показателя 2014 года (-23% при постоянных затратах). Это замедление в первую очередь связано с Северной Америкой, которая стимулировала рост в 2018 году. В 2019 году капитальные затраты в регионе упали на 7%, в то время как в остальном мире наблюдался умеренный рост на 2%. На офшорный сектор приходится 29% инвестиций, оставшиеся 71% приходятся на наземный сектор, из которых 25% приходится на сланцевую нефть.

    Инвестиции в разведку и добычу

    Ожидается, что в 2020 году спад глобальных инвестиций ускорится, сократившись примерно на 4% 1 на фоне продолжающегося сокращения в Северной Америке, а также спада в остальном мире.

    Рис. 1a — Глобальные инвестиции в разведку и добычу, 2015-2019 гг.

    На основе постоянных затрат, инвестиции оставались стагнирующими с 2016 г. (-0,4%) после резкого падения, зафиксированного в период с 2014 по 2016 гг. Текущий уровень недостаточен для обеспечения возобновления запасов, которые снизились на 8% с 2014 г. 2 .В ближайшие пять лет требуемые среднегодовые инвестиции на основе постоянных затрат оцениваются IFPEN в 660 миллиардов долларов, то есть на 22% выше, чем в 2019 году. В период 2020-2040 годов потребуется около 16 700 миллиардов долларов. инвестировано в сектор разведки и добычи нефти и газа для обеспечения добычи и возобновления запасов 3 .

    Рис. 1b — Инвестиции в разведку и добычу в 2019 году по типу месторождения

    В 2019 году капитальные затраты варьировались по регионам. В Европе он вырос на 21%, т. Е.е., 6,7 млрд долларов. Азия лидирует по абсолютному росту, показав прирост на 7,5 млрд долларов США, то есть на 11%. В Африке рост также составляет 11%, а в Южной Америке — 6%. В других странах инвестиции в Северной Америке существенно упали на 13,6 млрд долларов (7%). Они также упали в СНГ (-9%), Ближнем Востоке (-7%) и Океании (-4%). Тем не менее, Северная Америка остается лидером в области инвестиций. На его долю приходится 36% от общего объема мировых инвестиций, значительно опережая Азию, СНГ и Ближний Восток (12-14% от общего объема для каждого региона).

    В Европе на Норвегию и Соединенное Королевство приходится 82% инвестиций в 2019 году (из которых 56% приходится на Норвегию). Расходы резко выросли в Соединенном Королевстве, увеличившись более чем на 30% по сравнению с 2018 годом, в то время как в Норвегии рост приближается к 20%. Половина общих инвестиций была направлена ​​на разработку новых месторождений (в частности, Йохан Свердуп в Норвегии и Маринер в Соединенном Королевстве), а оставшиеся 50% были использованы для поддержания добычи на месторождениях, введенных в эксплуатацию до 2016 года, а также на демонтаж. инфраструктуры на истощенных месторождениях.

    В Азии Китай привлек более 60% региональных инвестиций в разведку и добычу в 2019 году, что составляет почти 80% роста инвестиций. На три китайских ННК (национальные нефтяные компании) приходится почти все (95%) капитальные затраты в нефтегазовом секторе страны, и эти расходы выросли на 15%. Sinopec лидирует в этой области с увеличением бюджета более чем на 3 млрд долларов (+ 63%) по сравнению с 2018 годом, за ней следуют Petrochina (+ 1,1 млрд долларов) и CNOOC (+ 0,8 млрд долларов). В других странах Азии инвестиции выросли на 1 доллар.2 миллиарда в Индии (+ 19%) и 0,5 миллиарда долларов в Индонезии (+ 8%), в то время как в Малайзии они остались на прежнем уровне и резко упали на 17% в Таиланде (-0,5 миллиарда долларов).

    В Африке рост инвестиций произошел за счет Мозамбика, Ливии, Алжира, Анголы и Мавритании. Напротив, в Египте и Нигерии инвестиции значительно упали. В Мозамбике большая часть расходов в настоящее время направляется на два текущих проекта СПГ: Mozambique LNG, возглавляемый Total, и Coral FLNG, возглавляемый ExxonMobil и ENI.Эти проекты будут продолжать обеспечивать инвестиции страны в следующие пять лет. В Ливии инвестиции подскочили на 35% за счет государственной компании, но их уровень все еще составляет менее одной трети от уровня 2010 года. В Алжире инвестиции Sonatrach, составляющие 75% от общего объема по стране, увеличились на 10%; большая часть из них была закачана на месторождения Хасси-Мессауд и Хасси-Р’Мел, а также на заводы по производству сжиженного природного газа в Скикде и Арзеве. В Анголе резкое падение инвестиций Sonangol (-26%) было более чем компенсировано увеличением бюджетов международных компаний (+ 38%) во главе с французской компанией Total.В Египте падение капитальных затрат в первую очередь связано с месторождениями Зор и Дельта Западного Нила, разработка которых началась в 2016 и 2015 годах соответственно, а инвестиции в настоящее время прекратились. Нигерия ощутила последствия сокращения бюджетов, выделенных Total и CNOOC на разработку морского месторождения Эгина, добыча на котором была начата в 2018 году после пяти лет разработки.

    В Центральной и Южной Америке инвестиции увеличились в Бразилии (+ 11%, т.е. + 1 доллар США.5 млрд), стимулированные разведкой подсолевых отложений в бассейнах Сантос и Кампос (Лула, Бузиос, Джубарте и др.). В других странах инвестиции резко выросли на 1,2 миллиарда долларов в Эквадоре (+ 81%), Гайане (+ 27%) и Колумбии (+ 13%), в то время как в Венесуэле продолжилось свободное падение (-41%).

    В Северной Америке инвестиции значительно упали в США (-14 миллиардов долларов) и Канаде (-3 миллиарда долларов), в то время как они увеличились в Мексике (+ 3 миллиарда долларов). В США в сектор сланцевой нефти, который привлекает 3/4 всех инвестиций страны в добычу нефти и газа, такие инвестиции сократились на 6% (-7 миллиардов долларов).Это снижение связано с перераспределением портфеля между независимыми компаниями, чьи капитальные затраты упали на 10 миллиардов долларов, и крупными компаниями, чьи расходы выросли на 3 миллиарда долларов. Инвестиции в традиционную нефть и газ упали на 14%, при этом особенно пострадали глубоководные шельфовые месторождения, которые сократились на 30% (-3,5 млрд долларов).

    Инвестиции либо остались на прежнем уровне, либо упали во всех странах СНГ, за исключением Украины, где они увеличились на 4%. Однако в абсолютном выражении уровень остается низким, поскольку на Украину приходится всего 1% инвестиций региона.В России, на которую приходится 68% всех инвестиций в регионе СНГ, инвестиции упали на 12%, то есть на 6,5 млрд долларов. Объемы капвложений резко упали у Газпрома, Роснефти, Лукойла и Сургутнефтегаза (около — 1 млрд долларов каждый). Инвестиции стабильны в Казахстане (-0,9%) и упали на 5% в Туркменистане.

    На Ближнем Востоке значительное падение инвестиций связано, прежде всего, с сокращением расходов в Иране (-67%) из-за ограничений на добычу нефти и ухода иностранных инвесторов из-за американских санкций.В других странах региона инвестиции довольно стабильны (-0,5%), хотя падение было более заметным в некоторых странах, в частности, в Саудовской Аравии (-1 млрд долларов США, т. Е. -4%) и Кувейте (-0,7 млрд долларов США, т. Е. -14 %).

    В Океании инвестиции в разведку и добычу упали на 7% в Австралии (что составляет 92% инвестиций зоны), что совпало с завершением нескольких проектов СПГ. Например, инвестиции в проект Ихтис, где добыча началась в 2018 году, снизились на 1,5 миллиарда долларов по сравнению с 2018 годом, и на 0 долларов.9 миллиардов на Wheatsone, где в 2018 году было запущено второе производственное предприятие. И наоборот, проекты Prelude и Pluto, которые были запущены в 2019 году, сохранили свой уровень инвестиций.

    В заключение, робкий рост, наблюдавшийся в 2017 и 2018 годах, не был поддержан в 2019 году и текущие прогнозы предполагают, что спад может усилиться в 2020 году. С 2016 года инвестиции стагнируют или даже немного сокращаются при неизменных затратах. . Сейчас они примерно на 20% ниже уровня, необходимого для возобновления запасов, и поэтому в будущем их придется увеличивать для удовлетворения постоянно растущего спроса.

    Глобальное наземное и морское бурение

    В 2019 году было пробурено 68 500 скважин на суше и 2 800 на море (рис. 2а). Напомним, в 2014 году, до падения цен на нефть, объем буровых работ по всему миру достиг 100 000 скважин. В 2019 году объем буровых работ в мире стабилизировался (+ 1%) после скачка, отмеченного в 2017 году (+ 25%) и 2018 году (+ 9%).

    Рис. 2а — Количество пробуренных скважин (мировое)

    Активность остается на 30% ниже уровня 2014 года. Объемы бурения на суше в целом стабильны и не увеличились, тогда как объем бурения на суше подскочил на 17%.

    На суше, за годичный период, регионы, в которых наблюдался наибольший рост, — это Азиатско-Тихоокеанский регион (+ 17%), Африка (+ 13%) и Европа (+ 12%), при этом во всех остальных регионах наблюдается либо стагнация, либо снижение (Рис. 2б). Бурение в Азиатско-Тихоокеанском регионе возглавил Китай (+ 20%), где ежегодно пробуривается более 22 000 скважин. Чтобы компенсировать истощение своих месторождений, Китай усилил свои геологоразведочные работы, пробурив 3000 новых скважин, особенно в бассейнах Ордос, Бохайского залива и Джуггар.Кроме того, Китай продолжил разведку и разработку сланцевого газа в бассейне Сычуань, и в 2019 году страна пробурила более 300 скважин на нетрадиционный газ. По оценкам, предоставленным Китаем, предполагается, что бассейн Сычуани представляет более 27 трлн 3 ресурсов, то есть 18% от общего газового потенциала Китая.

    Северная Америка — регион, в котором наблюдалось наибольшее снижение объемов буровых работ (-9%). Это падение является результатом замедления темпов бурения в сланцевых бассейнах США.Из 28 000 скважин, ежегодно пробуренных в США, нетрадиционные нефть и газ составляют 15 000 горизонтальных скважин.

    Рис. 2b — Объем буровых работ по регионам

    Несмотря на снижение объемов бурения, наблюдаемое в сланцевых бассейнах с начала 2019 года, добыча сланцевой нефти в США продолжала расти (рис. 3).

    Рис. 3 — Буровые работы в США — сланцевая нефть

    Действительно, количество завершенных метров и объем закачиваемых проппантов продолжали расти. Однако рост в 2019 году скорее всего будет равен 0.9 млн баррелей в сутки по сравнению с 2 млн баррелей в сутки в 2018 году. Операторы используют пробуренные, но незавершенные скважины 4 , из которых более 8000 (рис. 4).

    Рис. 4 — Количество скважин DUC по бассейнам (2014-2019)

    Эти буровые работы обычно проводятся при низких ценах на нефть или когда экспортная инфраструктура перегружена, а заканчивание скважин откладывается. Бурение этих скважин обеспечивает рентабельность буровых машин. В 2018 году вывоз и транспортировка добытых жидкостей пострадали из-за недостаточной пропускной способности инфраструктуры.С 2019 года ввод новых трубопроводов начал смягчать эту проблему. Однако заторы по-прежнему остаются проблемой для удаления газа, связанного с добычей нефти. Это связано с тем, что большие объемы добываемого газа, отсутствие транспортной инфраструктуры и низкая цена самого газа не позволяют операторам в полной мере использовать его с минимальными затратами, вынуждая их прибегать к сжиганию на факелах.

    В море после сокращения объемов морского бурения в 2017 и 2018 годах в этом секторе произошел значительный подъем в 2019 году (рис.5а). Регионами мира с самыми высокими темпами роста являются Европа (+ 40%), Китай (+ 40%), Ближний Восток (+ 27%) и Африка (+ 19%). В Европе эту деятельность стимулируют Великобритания в Северном море, Норвегия в Баренцевом море и, наконец, Румыния в Черном море. Китай располагает значительным парком морских буровых установок (57). Страна намерена возродить разведку и разработку месторождений нефти и газа, сняв обязательство использовать государственные компании. На Ближнем Востоке компании Qatar Petroleum и Total начали вторую фазу разработки гигантского морского месторождения Аль-Шахин, на которое будет приходиться 50% национальной добычи нефти.И, наконец, единственный регион, где объем морского бурения упал (-4%), — это СНГ.

    Рис. 5a — Рынок наземного бурения

    В 2019 году оборот (T / O), генерируемый наземным бурением во всем мире, вероятно, стабилизируется на уровне около 19 миллиардов долларов США, что на 4% меньше за год (Рис. 5a). Рынок еще не вернулся к уровню 2014 года, когда оборот составлял 35 миллиардов долларов.

    Рис. 5b — Рынок морского бурения

    После четырех лет падений совокупный доход от морского бурения, вероятно, стабилизируется на уровне около 24 миллиардов долларов — столько же, сколько в 2018 году, т.е.е., больше, чем T / O от наземного бурения всего с 2800 скважинами. После двух лет очень сильного роста рынок гидроразрыва пласта упал на 15% в 2019 году. Тем не менее, он по-прежнему представляет собой T / O в размере 30 миллиардов долларов, что вдвое больше, чем в 2015 году.

    На десять крупнейших береговых буровых компаний приходится 62% на мировом рынке (рис. 6а) и сопротивляются хорошо по сравнению с более мелкими компаниями, чьи операционные затраты резко упали. Рост рынка выдохся, в первую очередь из-за замедления темпов бурения в сланцевых бассейнах Северной Америки.В 2019 году аренда наземных буровых установок, возможно, выросла на 10% за годовой период в США, но в остальном мире они упали на 10%. В 2020 году рынок бурения стагнирует и останется на уровне 2019 года.

    Рис. 6a — Участники наземного бурения

    На десять крупнейших морских буровых компаний приходится 56% мирового рынка (Рис. 6b). Несмотря на трехкратное падение T / O за пятилетний период, Transocean остается лидером в этом секторе. Чтобы оставаться впереди, компания провела несколько операций по слиянию и поглощению, особенно в конце 2018 года с Ocean Rig.

    Второй по величине игрок — Valaris, созданный в результате слияния Ensco и Rowan, которые в 2018 году заняли 3-е и 5-е места соответственно. Китайский оператор COSL продолжает увеличивать долю рынка, но среди его буровых установок нет бурового судна.

    Рис. 6b — Игроки в области морского бурения

    Несмотря на увеличение количества операций по бурению на море, уровень загрузки буровых установок в мире составляет лишь 55%. Это оказало негативное влияние на рынок морского бурения, препятствуя сдаче в аренду буровых установок.Более того, сейчас на рынок поступают буровые установки, заказанные до 2015 года и строительство которых было остановлено в разгар кризиса.

    Кроме того, только небольшой процент законсервированных установок был демонтирован или переоборудован; остальные вернулись в строй. Тем не менее, в конечном итоге, учитывая количество находящихся в стадии реализации морских проектов, должна быть возможность поглотить любые избыточные мощности, и рынок должен вернуться к росту в 2020 году.

    Рынок гидроразрыва пласта стал одним из самых нестабильных сегментов сектора разведки и добычи ( Инжир.7а). В 2019 году это очень скоро отразило спад американского рынка наземного бурения.

    Однако увеличение количества операций ГРП, проводимых вдоль горизонтальных дренажных каналов, а также расширение дренажей и геометрия трещин привели к значительному увеличению продуктивности скважин. В 2020 году этот рынок, вероятно, стабилизируется при незначительном увеличении активности.

    Рис. 7a — Рынок гидроразрыва пласта (млрд долларов)

    С точки зрения игроков (рис. 7b) рынок гидроразрыва высококонцентрирован: только на три компании приходится 50% мирового рынка и на десять компаний приходится 80% рынка. .

    Halliburton остается лидером рынка, значительно опережая Schlumberger. За последние три года Liberty Oilfield Services и ProPetro, занявшие 3-е и 4-е места соответственно, увеличили долю рынка за счет Schlumberger.

    Рис. 7b — Участники рынка ГРП

    Геофизика в мире

    Геофизическая отрасль находится в начале разработки нефтяных и газовых месторождений и является показателем геологоразведочной деятельности. В 2019 году активность в этом секторе, наконец, начала восстанавливаться , с увеличением количества работающих лодок и размера мирового флота.Стоимость услуг, упавшая с 2014 года, восстановилась в 2019 году, увеличившись за год на 20-25%. Кризис, последовавший за падением цен на нефть в 2015 году, оказал фундаментальное влияние на позиционирование игроков благодаря слияниям и поглощениям и усилению позиций китайских подрядчиков.

    После пяти лет непрерывного сокращения количества судов для сейсморазведки, 2019 год стал поворотным моментом, когда мировой флот увеличился на 10%.

    В середине 2019 года насчитывалось около 120 судов различных типов (2D, 3D, источник), по сравнению со 110 в 2018 году и 140 в 2014 году.

    В середине 2019 года процент активных судов увеличился с 34% до 51% в год (рис. 8а). Напомним, до падения цен на нефть в 2015 году эта цифра составляла от 60 до 70%. При этом доля бездействующих судов снизилась на аналогичную величину — с 30% до 12%.

    Рис. 8a — Уровень занятости судов (%)

    Источники: IHS Markit et IFPEN

    Большинство судов флота расположено в пяти основных регионах, где сосредоточены оффшорные операции: Северо-Западная Европа (45%) с Северным и Баренцевым морями, Юго-Восточная Азия (22%), Латинская Америка (7%). ), Западной Африке (11%) и Северной Америке (6%) с Мексиканским заливом (GOM) (рис.8б).

    Рис. 8b — Расположение судов для сбора данных по регионам в середине 2019 г. (%)

    Источники: IHS Markit et IFPEN

    Европа все еще перепредставлена ​​из-за большого количества норвежских подрядчиков и судов.

    Наибольший рост флота произошел на Ближнем Востоке (+ 170%), Северной Америке (+ 70%) и Латинской Америке (+ 60%). В Западной Европе, Юго-Восточной Азии и Африке наблюдается застой, в то время как в Индийском океане, Средиземном море и Океании наблюдается спад на 20–30%.

    Операции по сбору морских сейсмических данных 3D продолжали доминировать, составляя 41% активности судов. Многоазимутальные съемки, которые почти исчезли в 2018 году из-за высоких сопутствующих затрат, снова появились, составляя 4% от общей активности. Эти операции частично объясняют увеличение доли активных судов-источников с 18 до 31% за год. Еще один признак, указывающий на изменение ситуации, 2D-съемка, объем которых значительно увеличился из-за более низких сопутствующих затрат, за год сократился вдвое, составив лишь 6% от общей активности (рис.9а).

    В глобальном масштабе специализированные морские исследования с использованием донных кабелей океана ( OBCs ), донных узлов океана ( OBN ) или электромагнетизма и повторных сейсмических съемок (4D) 5 представляют такой же объем сбора данных (менее 20%). обзоров).

    Рис. 9a — Характер морских сейсмических исследований середина 2019 г.

    Рост активности отражен в ежедневной стоимости исследований, которая значительно выросла с начала 2019 г. (Рис. 9b).

    Рисунок 9b — Динамика дневной цены по типу опроса

    Источники: IHS Markit et IFPEN

    За один год средняя цена 3D-съемок выросла на 20%, а 2D-съемок — на 25%. Стоимость высокоуровневой 3D-съемки сейчас составляет 250 000 долларов в день, а двухмерная съемка стоит половину или даже треть от суммы. В период с 2015 по 2017 год, когда спад активности был на пике, стоимость 2D-съемки была сопоставима с арендой судна-источника.Кажется, что проблемы избыточных мощностей флота по отношению к спросу уменьшаются.

    После четырех лет спада в мировом геофизическом секторе 2018 год уже принес с собой возврат к росту с увеличением на 4%. Кризис привел к радикальной перестройке рынка (рис. 10а).

    Рис. 10a — Доля рынка по игрокам (%)

    Источники: Spears & Associates et IFPEN

    Исчезли самые слабые игроки, остались только те подрядчики, которым удалось рефинансировать и реструктурировать.SAE Exploration приобрела основные активы, ранее принадлежавшие Geokenetics, которая обанкротилась в 2018 году. Magseis купила Fairfield, чтобы стать лидером в секторе OBN.

    В секторе программного обеспечения для разведки и добычи Emerson купила Paradgim в 2017 году. WesternGeco, дочерняя компания Schlumberger, занимающаяся морской сейсмикой, и CGG прекратили контрактную морскую деятельность. Подрядчики переориентировали свою деятельность на геолого-геофизические исследования и продажу сейсмических данных для нескольких клиентов, бизнес-модель которой теперь является примером для подражания; в настоящее время подрядчикам выгоднее жить за счет своих библиотек сейсмических данных и многоклиентских сборов.Когда цены на морские исследования вырастут достаточно значительно, чтобы покрыть расходы, сейсморазведочные подрядчики смогут оправдать приобретение флота судов, предназначенных для сбора данных по контрактам.

    В 2019 году CGG намерена продолжить сокращение своего флота, и к концу 2019 года компания планирует иметь всего три судна по сравнению с 12 тремя годами ранее. Его цель — сосредоточиться в первую очередь на опросах нескольких клиентов. Компания Shearwater Geoservices купила суда WesternGeco и теперь владеет 23 судами, из которых только 14 являются действующими.Это делает его крупнейшим в мире флотом. В ближайшем будущем PGS планирует владеть флотом из 8 судов.

    Приобретение Spectrum компанией TGS вступило в силу с августа 2019 года, при этом TGS сохранила свою модель освещения актива, основанную на многоклиентских опросах, и расширила объем своих 2D- и 3D-библиотек.

    Китайские подрядчики COSL и BGP укрепляют свои позиции в секторе морских закупок; они расширили свою деятельность за пределы Азии, включив Африку и Ближний Восток.

    Ожидается, что в 2019 году оборот мирового рынка геофизики (все сегменты вместе взятые) вырастет на 15% до отметки около 9 миллиардов долларов (рис. 10b).

    Рис. 10b — Мировой рынок геофизики (млрд долларов)

    В 2018 году продолжился значительный рост сектора оборудования (+ 50%), обусловленный продажей наземного сейсмического оборудования. Напротив, сектор морских сейсморазведочных работ сократился.

    В 2020 году рынок геофизики, вероятно, продолжит расти темпами, сопоставимыми с темпами 2019 года.Тем не менее, чтобы раз и навсегда оставить кризис позади и избежать возврата к избыточным мощностям с точки зрения ресурсов для приобретения, компаниям с крупнейшим флотом судов (Shearmater и PGS) придется принять разумные решения, чтобы вернуть их на плаву. рынок.

    В то время как мировое потребление нефти и газа продолжает расти, нефтегазовые операторы должны продолжать свои усилия по разведке, чтобы возобновить свои запасы. Объемы нефти и газа, обнаруженные за последние три года, составляют около 10 Гбнэ в год , тогда как до 2015 года они составляли от 15 до 20 Гбнэ.По оценкам ОПЕК, до 2040 года потребуются инвестиции в разведку и добычу в размере 8000 миллиардов долларов, чтобы компенсировать сокращение мировых запасов, то есть около 400 миллиардов долларов в год.

    Морское строительство в мире

    Offshore представляет 28% запасов углеводородов и 28% мировой добычи. 75% обнаруженных объемов открыто на море. Предлагая более легкий доступ к запасам нефти и газа, чем наземный сектор, этот сектор остается важным для крупных компаний.

    В 2019 году количество одобренных шельфовых проектов увеличилось на 6% (рис. 11а). Начиная с самой низкой точки в 2016 году, это третий год подряд роста; количество проектов увеличилось втрое, сейчас одобрено более 90 проектов. Нефтегазовые компании, отложив реализацию проектов разработки, столкнулись с проблемой сохранения добычи. Возвращение к стабильности цены за баррель (выше 60 долларов) делает проекты, ранее переведенные в режим ожидания, жизнеспособными.Большинство проектов (46%) относятся к стационарным платформам, 41% — к подводным проектам и 13% — к плавучим платформам (FPU 6 для глубоководных морских платформ).

    Рис. 11a — Количество и тип одобренных морских проектов

    Источник: Rystad Energy

    Во всем мире количество плавучих проектов значительно увеличилось на (33%), в основном за счет Южной Америки (рис. 11b). Действительно, Южная Америка — единственный регион, где большинство проектов находится на плаву, в частности, Бразилия использует многочисленные блоки FPSO.

    FPSO — самая популярная в мире плавучая система, в частности, благодаря ее технической гибкости и быстрому запуску производства. Другие типы плавучих платформ: TLP, Spar, Semisub и FLNG представляют лишь несколько единиц.

    Количество подводных проектов 7 остается стабильным (39) в течение года. Небольшое падение в Европе было компенсировано развитием проектов в Северной и Южной Америке. Такой тип разработки позволяет в уже освоенных нефтегазовых регионах подключать новые скважины к существующим стационарным или плавучим сооружениям.Это особенно характерно для Северного моря и Мексиканского залива, где производственные операции велись в течение нескольких десятилетий.

    Рис. 11b — Расположение оффшорных проектов в 2019 г.

    Источник: Rystad Energy

    Количество фиксированных проектов продолжает расти (+ 5%). Этот метод производства широко используется в Азии, на Ближнем Востоке и в Африке. Идеален для мелководных районов (до 300 метров), где дешевле других методов.

    Три географических зоны с наибольшим количеством оффшорных проектов: Азия (21%), Европа (20%) и Северная Америка (19%).

    В Азии, учитывая мелководье, проекты развития в первую очередь касаются стационарных платформ (85%). Тем не менее, в Индии Reliance и BP одобрили разработку сверхглубокого газоконденсатного месторождения МДж (блок KG-D6), которое будет подключено к FPSO. В Западной Австралии Woodside запускает несколько газовых проектов, в том числе месторождение Скарборо с подводным соединением с заводом по производству СПГ Плутон и проект Browse, направленный на подключение месторождений Брекнек, Каллианс и Тороса к FPSO.

    В Мексиканском заливе в США компания Shell приняла окончательное решение об инвестировании в глубоководный проект PowerNap, в который TechnipFMC внесет свой вклад. Для разработки месторождения Кит, Shell намеревается использовать полупогружную платформу, очень похожую на ту, что используется на месторождении Вито. Компания Murphy Oil санкционировала глубоководную разработку месторождений Khalesi, Mornant и Samurai, которая будет связана с FPS на Королевской набережной.

    Южная Америка демонстрирует признаки восстановления.В Аргентине были успешно выданы первые морские лицензии, особенно в отношении Фолклендского бассейна у Огненной Земли. В Гайане ExxonMobil утвердила вторую фазу разработки месторождения Лиза. Общие затраты на разработку проекта составляют около 6 миллиардов долларов, включая 1,6 миллиарда долларов, выделенных на FPSO. Бразилия планирует два аукциона, в том числе один, посвященный подсолевым шельфам. Ноябрьские аукционы не оправдали ожиданий, единственными участниками торгов были Petrobras и Китай.Что касается Pemex, то в 2019 году нацкомпания планирует разработать около двадцати месторождений в акватории Мексиканского залива.

    В Африке заявлено о нескольких проектах разработки морских месторождений. Например, BP приняла окончательное решение инвестировать в проект Greater Tortue, расположенный на границе между водами Мавритании и Сенегала. BP также работает над развитием проекта PAJ у побережья Ганы. Космос планирует использовать привязку для разработки открытия G-13 в Экваториальной Гвинее.

    В Европе очень активна Норвегия. AkerBP получил зеленый свет на начало производственных операций на месторождении Valhall Flank West в Центральном Грабене (запасы 46 млн баррелей нефтяного эквивалента). Equinor сообщил своим партнерам, что ввод в эксплуатацию гигантского месторождения Johan Sverdrup (запасы 2200 млн баррелей нефтяного эквивалента) будет ускорен. В Великобритании Premier Oil одобрила предстоящую разработку месторождений Catcher (24 млн баррелей нефтяного эквивалента) и Laverda (4 млн баррелей нефтяного эквивалента).

    С другой стороны, количество проектов по выводу из эксплуатации в Северном море увеличивается с количеством месторождений с истекшим сроком эксплуатации .По оценкам Boston Consulting Group, в ближайшее десятилетие в Северном море предстоит демонтировать более 700 платформ. Планируется, что количество скважин, подлежащих закрытию или заглушке, достигнет 7000. Для нефтегазового ведомства Великобритании эти операции по демонтажу инфраструктуры оцениваются примерно в 50 миллиардов фунтов стерлингов. Для Rystad Energy краткосрочный рынок оценивается в 6,5 млрд фунтов стерлингов. Для того, чтобы позиционировать себя на этом рынке, было создано множество компаний: Fairfield Decom, Well-Safe Solutions, Maersk Decom, Offshore Decommissioning Services, Petrodec и т. Д.Однако проблема, с которой они сталкиваются, заключается в недостаточной видимости рынка, поскольку операторы отодвигают графики демонтажа, пытаясь максимизировать извлечение месторождений.

    В 2019 году продолжающийся рост количества одобренных проектов привел к 8% -ному росту рынка морского строительства и услуг за год. В 2019 году рынок оценивается примерно в 39 миллиардов долларов. Это второй год роста после кризиса 2014 года. С тех пор рынок стоимостью 80 миллиардов долларов в 2014 году снизился вдвое.

    Три основных сегмента рынка выросли в 2019 году. Сегмент рынка подводных разработок, который составляет 32% от общей выручки от строительства морских объектов, вырос за год на 12%. Восстановление в Европе идет медленно, с ежедневным ростом затрат, но многие подводные компании не пережили кризис. Во флоте судов по-прежнему есть избыточные мощности.

    Более половины мирового рынка морского строительства (54%) приходится на строительство платформ. Вместе со всеми типами (фиксированные, плавающие, FPU) этот рынок вырос в стоимости на 6% по сравнению с 2018 годом.

    Сектор судов обслуживания и снабжения вырос в 2019 году на 9%. Этот рынок, хотя и зависит от новых разработок, также зависит от операций по техническому обслуживанию и поставке существующих платформ (рис. 12a).

    Рис. 12a — Морское строительство и сопутствующие услуги

    Источники: IFPEN, Spears & Associates

    На пять компаний приходится 50% мирового рынка морского строительства (рис. 12b).

    Рис. 12b — Морское строительство и сопутствующие услуги

    Источники: IFPEN, Spears & Associates

    TechnipFMC — лидер сектора с оценочной долей рынка более 20%.В начале 2020 года компания должна быть разделена на две компании. Первая, которая сохранит свое нынешнее название, будет отвечать за оборудование для добычи нефти на суше и на море; он будет базироваться в Техасе. Второй, специализирующийся на проектировании и строительстве инфраструктуры для добычи нефти и газа, нефтехимических предприятий и нефтеперерабатывающих заводов, будет базироваться в Париже. Он будет называться Technip Energies. Итальянская компания Saipem занимает второе место в секторе морского строительства, за ней следует британский специалист по морской разработке Subsea 7.MC Dermott, американская компания, базирующаяся в Хьюстоне, занимает четвертое место.

    В 2020 году восстановление в секторе морского строительства, вероятно, продолжится с ростом на 8%. Тем не менее, это восстановление будет зависеть от количества проектов, фактически прошедших штамп и повышения цен на услуги.

    ОБЩАЯ ТАБЛИЦА ИНВЕСТИЦИЙ И РЫНКОВ (2018 и 2019)


    Geoffroy Hureau [email protected]

    Sylvain Serbutoviez [email protected]

    Проект внесен в феврале 2020 г. 


    (1) Согласно данным, предоставленным Rystad Energy

    (2) Там же. Доказанные запасы

    (3) Оценка IFPEN с гипотезами спроса из сценария SPS МЭА

    (4) DUC (пробурено незавершено)

    (5) Трехмерная сейсмическая съемка называется четырехмерной, если она строго повторяет схему сбора данных первой трехмерной сейсмической привязки

    (6) FPU: Блок плавучей платформы, платформа для хранения, сжижения или производства

    (7) Подводный проект разрабатывается без платформы, но от подводных устьев скважин и соединителей (затяжек) до существующей инфраструктуры

    Нефтегазовая промышленность на Ближнем Востоке

    Киберпреступники, как известно, обращают внимание на текущие события, чтобы сделать свои схемы и кампании более привлекательными и актуальными для ничего не подозревающих жертв.Эти мероприятия не обязательно должны быть глобальными по своему характеру и часто представляют только местный или региональный интерес. Это помогает злоумышленникам сузить цель в надежде на больший шанс на успех.

    Таким образом, когда Национальная нефтяная компания Абу-Даби (ADNOC) прекращает действия ранее заключенных контрактов на проектирование, закупки и строительство (EPC), внимательные киберпреступники получают новую пищу для другой схемы.

    С июля 2020 года команда Zscaler ThreatLabZ наблюдала рост целевых атак на несколько организаций, связанных с цепочками поставок, в нефтегазовом секторе на Ближнем Востоке.Мы обнаружили несколько экземпляров вредоносных PDF-файлов, отправленных в виде вложений к электронным письмам, и использовали их для распространения среди этих организаций трояна, ворующего информацию, AZORult.

    В этом блоге мы подробно описываем эту кампанию, объясняем векторы атак, стратегию распространения вредоносных программ и атрибуцию угроз.

    Стратегия распространения

    Цепочка атаки начинается с электронного письма, которое, похоже, отправлено официальным лицом, работающим в ADNOC, и нацелено на должностных лиц, работающих в цепочке поставок и правительственном секторе на Ближнем Востоке.

    К каждому электронному письму в этой кампании прикреплен файл PDF. Этот PDF-файл содержит ссылки для загрузки на первой странице, которые ведут на законные сайты обмена файлами, такие как wetransfer и mega.nz, где размещен ZIP-архив. ZIP-архив содержит вредоносный и упакованный исполняемый файл .NET, который расшифровывает, загружает и выполняет встроенный двоичный файл AZORult. На рисунке 1 показано графическое представление потока атаки.

    Рисунок 1: Последовательность атаки

    Анализ электронной почты

    На рисунке 2 показано электронное сообщение, которое якобы пришло от старшего химика лаборатории ADNOC Sour Gas.

    Рис. 2. Поддельное электронное письмо, отправленное должностным лицам в сфере цепочки поставок на Ближнем Востоке.

    Во всех случаях электронные письма были отправлены с адреса Gmail. В ходе атак наблюдались два адреса Gmail:

    [электронная почта защищена]

    [электронная почта защищена]

    Злоумышленник также использовал анонимные почтовые службы Тутаноты для создания электронных писем, зарегистрированных на keemail.me и tuta.io, которые также использовались в этой почтовой кампании.

    Файлы PDF, прикрепленные к электронному письму, представляют собой многостраничные документы (содержащие 14 страниц), которые выглядят как запросы предложений (RFQ) для контрактов на поставку и юридических тендеров для различных проектов, связанных с ADNOC и аэропортом Доха. Документы-приманки тщательно созданы, чтобы они выглядели законными для целей социальной инженерии. На первой странице каждого документа содержатся инструкции по доступу к спецификациям и чертежам с использованием встроенных ссылок для загрузки, которые ведут к вредоносным ZIP-архивам, как описано в потоке атаки выше.

    Некоторые примеры содержимого в PDF-файлах включают:

    Имя файла PDF: PI-18031 Проект разработки газа Далма (Пакет B) — ТЕНДЕРНЫЙ БЮЛЛЕТЕНЬ-01.pdf

    MD5 hash: e368837a6cc3f6ec5dffae9e9a220 PDF-файл, который претендует на то, чтобы быть законным запросом котировок (RFQ), относящимся к проекту разработки газа Далма. Он имеет логотип ADNOC в правом верхнем углу, а первая страница содержит вредоносные ссылки для загрузки.

    Рисунок 3. Поддельное письмо, содержащееся в PDF-файле, связанном с этой атакой.

    Имя файла PDF: AJC-QA РАСШИРЕНИЕ МЕЖДУНАРОДНОГО АЭРОПОРТА ХАМАДА, DOHA.pdf

    Хеш MD5: abab000b3162ed6001ed8a11024dd21c

    На рис. для Дохи и предположительно поступает от подрядчика по цепочке поставок в Катаре.

    Рис. 4. Поддельный запрос предложения на проект расширения местного аэропорта.

    Атрибуция угрозы

    Субъект угрозы особенно заинтересован в ближневосточных целях, таких как организации в цепочке поставок и правительственные секторы Ближнего Востока, особенно Объединенных Арабских Эмиратов (ОАЭ) и Катара.

    На основании целевых получателей электронной почты, содержимого электронной почты и прикрепленных файлов PDF, а также анализа метаданных и инфраструктуры мы делаем вывод, что это целенаправленная атака на организации на Ближнем Востоке.

    Анализ метаданных

    После исследования метаданных файлов PDF мы смогли обнаружить несколько PDF-файлов, которые связаны с одним и тем же злоумышленником. Этот метод распространения использовался в естественных условиях с января 2020 года по май 2020 года в небольших объемах.

    Начиная с июля 2020 года мы наблюдали рост активности этого злоумышленника, который вернулся с новой кампанией.

    Метаданные файлов PDF показывают, что они были созданы с помощью Microsoft Office Word 2013.Во всех образцах PDF использовались только уникальные имена авторов:

    Donor1

    Mr. Adeel

    На рисунке 5 показан пример метаданных для файла PDF с хешем MD5 e368837a6cc3f6ec5dfae9a71203f2e2.

    Рисунок 5. Метаданные одного из файлов PDF, используемых в этой кампании.

    Полный список всех образцов PDF, выявленных в этой кампании, представлен в Приложении.

    Анализ инфраструктуры

    В дополнение к содержимому электронных писем и документов, которые использовались для атрибуции угрозы, мы также можем сделать вывод из инфраструктуры управления и контроля (C&C), что злоумышленник специально выбрал C&C сервер, который гармонирует с темой.

    Сервер C&C в обнаруженных нами образцах был crevisoft.net.

    Во время анализа этот домен разрешался в IP-адрес 167.114.57.136. Мы заметили, что этот домен при прямом доступе будет перенаправлять на сервисную консалтинговую компанию из Египта, размещенную на crevisoft.com, как показано на рисунке 6.

    Рисунок 6. Законный сайт на Ближнем Востоке, размещенный на crevisoft .com.

    Все следующие четыре домена будут перенаправлять на указанный выше домен:

    crevisoft.net

    cis.sh

    crevisoft.org

    crevisoft.co

    С высокой степенью достоверности можно сделать вывод, что этот злоумышленник заинтересован в краже информации и получении доступа к инфраструктуре организаций, связанных с цепочкой поставок, расположенных в Средний Восток.

    Технический анализ полезной нагрузки .NET

    В целях технического анализа мы рассмотрим двоичный файл .NET с хешем MD5: 84e7b5a60cd771173b75a775e0399bc7

    Эта полезная нагрузка, которая присутствует в загруженном ZIP-архиве, является упакованы и запутаны.NET двоичный.

    На основе статического анализа мы видим, что полезная нагрузка представляет собой приложение Skype с поддельными метаданными, как показано на рисунке 7.

    Рисунок 7: Метаданные основного исполняемого файла .NET.

    После выполнения распаковывает другую полезную нагрузку, встроенную в раздел ресурсов. На рисунке 8 показан специальный алгоритм, который расшифровывает полезную нагрузку с помощью жестко запрограммированного ключа «GXR20».

    Рисунок 8: Подпрограмма, используемая для дешифрования второго этапа.NET DLL.

    Второй этап

    На рисунке 9 показана расшифрованная полезная нагрузка, которая представляет собой .NET DLL с хешем MD5 0988195ab961071b4aa2d7a8c8e6372d и именем Aphrodite.dll

    unpacked загружена DLL второй ступени под названием Aphrodite.

    Выполнение кода передается в DLL путем создания объекта для класса с именем «Mortiz.Anton» вместе со следующими тремя параметрами, как показано на рисунке 10.

    ugz1: «ddLPjs» (имя ресурса растрового изображения)

    ugz3: «KKBxPQsGk» (ключ дешифрования)

    projName: «Skype» (имя проекта основного исполняемого файла)

    7 Рисунок 10: Управление кодом передано в Aphrodite DLL.

    Эта DLL дополнительно распаковывает другой двоичный файл, который внедряется как растровое изображение в раздел ресурсов основного исполняемого файла, как показано на рисунке 11.

    Рисунок 11. Растровое изображение внутри раздела ресурсов, которое содержит полезную нагрузку следующего этапа.

    Подобно второму этапу (Афродита), он также шифруется с помощью специального алгоритма. Пользовательский алгоритм основан на XOR с использованием ключа, указанного параметром ugz3 .

    Третий этап

    В результате распакованный двоичный файл представляет собой .NET DLL с хешем MD5 ae5f14478d5e06c1b2dc2685cbe992c1 и именем Jupiter.

    Управление кодом передается DLL третьей ступени через вызов одной из ее подпрограмм, как показано на рисунке 12.

    Рисунок 12: Распакованная и загруженная DLL третьей ступени, называемая Jupiter.

    Эта DLL третьего уровня использует различные методы для обнаружения присутствия виртуализации или среды анализа.

    Методы уклонения

    Ниже приводится сводка методов, используемых этой DLL для обнаружения среды анализа.

    Проверки реестра:

    Ключ реестра: «HARDWARE \ DEVICEMAP \ Scsi \ Scsi Port 0 \ Scsi Bus 0 \\ Target Id 0 \\ Logical Unit Id 0»

    Значение: «Идентификатор»

    Данные содержат: «VBOX» ИЛИ «VMWARE» ИЛИ «QEMU»

    Ключ реестра: «HARDWARE \\ Описание \\ System»

    Значение: «SystemBiosVersion»

    Данные содержат: «VBOX» ИЛИ «QEMU»

    Ключ реестра: «HARDWARE \\ Описание \\ System»

    Значение: «VideoBiosVersion»

    Данные содержат: «VIRTUALBOX»

    Проверяет наличие ключа: «Oracle \\ \ VirtualBox Guest Additions «ИЛИ» ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ \\ VMware, Inc.\\ VMware Tools «

    Ключ реестра:» HARDWARE \ DEVICEMAP \ Scsi \\ Scsi Port 1 \ Scsi Bus 0 \\ Target Id 0 \\ Logical Unit Id 0 «

    Значение:« Идентификатор »

    Данные содержат: «VMWARE»

    Ключ реестра: «HARDWARE \\ DEVICEMAP \\ Scsi \\ Scsi Port 2 \\ Scsi Bus 0 \\ Target Id 0 \\ Logical Unit Id 0»

    Значение: «Идентификатор «

    Данные содержат:« VMWARE »

    Ключ реестра:« SYSTEM \\ ControlSet001 \\ Services \\ Disk \\ Enum »

    Значение:« 0 »

    Данные содержат:« VMWARE »

    Ключ реестра: «SYSTEM \\ ControlSet001 \\ Control \\ Class \\ {4D36E968-E325-11CE-BFC1-08002BE10318} \\ 0000»

    Значение: «DriverDesc»

    Данные содержат: «VMWARE»

    Ключ реестра:

    «SYSTEM \\ ControlSet001 \\ Control \\ Class \\ {4D36E968-E325-11CE-BFC1-08002BE10318} \\ 0000 \\ Settings»

    Значение: «Описание устройства»

    Данные содержат: » VMWARE «

    Ключ реестра: «SOFTWARE \ VMware, Inc.\\ VMware Tools «

    Значение:» InstallPath «

    Данные содержат:» C: \\ PROGRAM FILES \\ VMWARE \\ VMWARE TOOLS \\ «

    Обнаружение среды Wine:

    Проверяет, выполняется ли экспорт функции kernel32.dll содержат: wine_get_unix_file_name

    Инструментарий управления Windows (WMI) на основе запросов проверок:

    Запрос WMI: «SELECT * FROM Win32_VideoController»

    Свойство: «Описание» Проверяет

    наличие следующих ключевых слов в поле описания:

    • «Дополнения VM S3 Trio32 / 64»
    • «S3 Trio32 / 64»
    • «Графический адаптер VirtualBox»
    • «VMware SVGA II»
    • «VMWARE»

    Проверки на основе имени DLL:

    Проверяет наличие библиотеки DLL с именем: «SbieDll.dll «в адресном пространстве процесса.

    Проверки на основе имени пользователя:

    Проверяет, содержит ли системное имя пользователя одну из следующих строк:

    • » ПОЛЬЗОВАТЕЛЬ «
    • » SANDBOX «
    • » ВИРУС «
    • » ВРЕДОНОСНОЕ ПО «
    • » SCHMIDTI «
    • » CURRENTUSER «

    Проверки на основе имени файла или пути к файлу:

    FilePath содержит:» // ВИРУС «ИЛИ» Песочный ящик «ИЛИ» ОБРАЗЕЦ «ИЛИ» C: \\ файл. exe «

    Проверка класса окна:

    » Afx: 400000: 0 «

    После выполнения всех вышеперечисленных проверок среды полезная нагрузка AZORult (хэш MD5: 38360115294c49538ab15b5ec3037a77) вводится с использованием метода полого новый экземпляр основного процесса.

    Мы не будем описывать подробности функциональности AZORult information stealer, поскольку она уже хорошо документирована в открытом доступе.

    Важно отметить, что, исходя из последовательности выполнения кода и используемых методов антианализа, полезная нагрузка, упакованная в .NET, создается с помощью упаковщика CyaX. Более подробную информацию об этом пакере можно найти здесь.

    Сетевое взаимодействие

    Последняя распакованная полезная нагрузка, AZORult, будет выполнять действия по краже информации на машине и извлекать информацию, отправляя запрос HTTP POST на URL: hxxp: // crevisoft.net / images / background / ob / index.php

    После проверки мы обнаружили, что opendir был включен на C&C сервере, как показано на рисунке 13.

    Рисунок 13: Opendir включен на C&C сервере.

    Панель AZORult на C&C сервере доступна по адресу URL: hxxp: //crevisoft.net/images/backgrounds/ob/panel/admin.php.

    Рисунок 14: Панель AZORult

    Скрипт почтовой программы PHP

    Среди других артефактов, обнаруженных на сервере C&C, мы обнаружили почтовый скрипт PHP, развернутый по адресу hxxp: // crevisoft [.] net / images / — / leaf.php.

    Это позволяет злоумышленнику отправлять электронные письма, используя SMTP C&C сервера.

    Рисунок 15. Скрипт почтовой рассылки PHP на C&C сервере.

    Обнаружение Zscaler Cloud Sandbox

    На рисунке 16 показано, как Zscaler Cloud Sandbox успешно обнаруживает эту угрозу на основе .NET.

    Рисунок 16. Обнаружение Zscaler Cloud Sandbox.

    Помимо обнаружения в песочнице, многоуровневая облачная платформа безопасности Zscaler обнаруживает индикаторы на различных уровнях, как показано здесь:

    Win32.PWS.Azorult

    Win64.PWS.Azorult

    PDF.Downloader.Azorult

    Заключение

    Этот злоумышленник нацелен на сотрудников в секторах цепочки поставок в нефтегазовом секторе в регионе Ближнего Востока. Как всегда, пользователи должны проявлять осторожность при получении писем на ровном месте, даже если кажется, что эти письма связаны с чем-то, что вас интересует, например, с законным платежным средством для проекта, который может показаться актуальным. И всегда будьте осторожны со ссылками, встроенными в форматы файлов, такие как PDF, поскольку эти ссылки могут привести к загрузке вредоносных файлов в вашу систему.

    Команда Zscaler ThreatLabZ продолжит мониторинг этой, а также других кампаний, чтобы обеспечить безопасность наших клиентов.

    MITER ATT & CK Сопоставление TTP

    000 966 ​​00 924 900

    00070007 9000OR 9000OR

    0

    0

    0

    0

    0 Открытие

    0

    0

    48

    48 Реестр запросов

    ID

    Tactic

    000

    Использует вложения PDF, содержащие вредоносные URL-адреса

    T1204.002

    Выполнение пользователем: вредоносный файл

    Пользователь открывает файл PDF. Щелкните ссылку URL. Скачивает ZIP-файл. Извлекает zip-файл и запускает двоичный файл.

    T1140

    Деобфускация / декодирование файлов или информации

    Строки и другие данные скрываются в полезной нагрузке.

    T1036.005

    Маскарадинг: соответствие законному имени или местоположению

    Имена файлов, используемые для проектов, напрямую связанных с Ближним Востоком.

    T1027.002

    Обфусцированные файлы или информация: упаковка программного обеспечения

    Полезные нагрузки упаковываются с помощью многослойного упаковщика.

    T1497

    Виртуализация / обход песочницы

    Использует реестр, WMI, методы защиты от виртуальных машин на основе имени пользователя

    ken T1134.002

    7 с токеном

    Одна из возможностей AZORult

    T1555.003

    Учетные данные из хранилищ паролей: Учетные данные из веб-браузеров

    Одна из возможностей AZORult

    T1140

    Деобфускация / декодирование файлов

    T1573.001

    Зашифрованный канал: симметричная криптография

    Одна из возможностей AZORult

    T1083

    Т1070.004

    Удаление индикатора на хосте: Удаление файла

    Одна из возможностей AZORult

    T1105

    Ingress Tool Transfer

    024

    49000

    00

    49000

    Обнаружение процесса

    Одна из возможностей AZORult

    T1055.012

    Внедрение процесса: Вытеснение процесса

    Одна из возможностей AZORult 48

    Одна из возможностей AZORult

    T1113

    Захват экрана

    Одна из возможностей AZORult

    435

    435 Информация о системе

    Одна из возможностей AZORult

    T1016

    Обнаружение конфигурации сети системы

    Одна из возможностей AZORult

    T103307

    5 Пользовательская система

    5 возможностей AZORult

    T1124

    Обнаружение системного времени

    Одна из возможностей AZORult

    T1552.001

    Незащищенные учетные данные: учетные данные в файлах

    Одна из возможностей AZORult

    Индикаторы компрометации

    Индикаторы компрометации 9000 9000 000 000 0009 Назначение имен задач

    : «Updates \ »

    Updates \ YJSlNpkH

    Updates \ WWOsRUUn

    Updates \ NcojkRtJmDPru

    XML-файлов

    создаются задачи, созданные с использованием имен файлов XML

    % каталог со случайными именами.

    C: \ Users \ user \ AppData \ Local \ Temp \ tmp9AA2.tmp

    C: \ Users \ user \ AppData \ Local \ Temp \ tmp23B7.tmp

    C: \ Users \ user \ AppData \ Local \ Temp \ tmp24CC.tmp

    Пропавшие имена файлов

    Файлы удаляются в каталог «AppData \ Roaming» с тем же именем, что и запланированная задача.

    C: \ Users \ User \ AppData \ Roaming \ YJSlNpkH.Exe

    C: \ Users \ User \ AppData \ Roaming \ WWOsRUUn.Exe

    C: \ Users \ user \ AppData \ Roaming \ NcojkRtJmDPru.Exe

    Файл хэшей

    PDF хэши

    Автор: Donor1

    e368837a6cc3f6ec5dfae9a71203f2e2

    741f66311653f41f226cbc45ca4

    fe

    2d87b18cb0d0820eca3bf047a

    8fe5f4c646fd1caa71cb772ed11ce2e5

    d8e3637efba977b09faf30ca49d75005

    c4380b4cd776bbe06528e70d5554ff63

    34cae3ae03a2ef9bc4056ca72adb73fc

    363030120a612974b1eb53cc438bafcb

    2710cc01302c480cd7cd28251743faf0 1693f1186a3f1f683893b41b919

    7a016c37fa50989e082b7f1ca2826f04 709895dd53d55eec5a556cf1544fc5b9

    5d9ed128316cfa8ee62b91c75c28acd1 c2ac9c87780e20e609ba8c99d736bec1

    269cfd5b77ddf5cb8c852c78c47c7c4c 653f85816361c108adc54a2a1fadadcf

    6944f771f95a94e8c1839578523f5415 8e5c562186c39d7ec4b389 76f9752297

    3d019ede3100c29abea7a7d3f05c642b

    67f178fd202aee0a0b70d153b867cb5e

    39598369bfca26da8fc4d71be4165ab4

    70a92fdba79eaca554ad6740230e7b9a

    9db3d79403f09b3d216ee84e4ee28ed3

    bafdeef536c4a4f4acef6bdea0986c0b

    8d7785c8142c86eb2668a3e8f36c5520

    653e737fd4433a7cfe16df3768f1c07e

    ebdcb07d3de1c8d426f1e73ef4eb10f4

    d258ba34b48bd0013bfce3308576d644

    a74c619fd61381a51734235c0539e827

    6f1bd3cb6e104ed6607e148086b1e171

    cf04d33371a72d37e6b0e1606c7cd9a2

    ede5fa9b9af1aeb13a2f54da992e0c37

    5321cd5b520d0d7c9100c7d66e8274e1

    de521f9e4bc6e934bb911f4db4a92d36

    36e572639

    91b6d38150eb778ea7

    1c5cb47fd95373ade75d61c1ae366f8b b7b41d93709777780712f52a9acf7a26

    62a05b00c7e7605f7b856c05c89ee748 b520f4f9d87940a55363161491e69306

    40c1156d98 c39ac08fd925d86775586d

    Автор: Mr.Адиль

    f2319ddb303c2a5b31b05d8d77e08b4e

    24e67f40ccb69edb88cc9

    ef2ffe

    54fc7650a8b5c1c8dc85e84732a6d2c7

    9cf615982d69d25b1d0057617bd72a95

    e9dfa14e4f6048b6f3d0201b2f3c62fe

    abab000b3162ed6001ed8a11024dd21c

    5c857bf3cf52609ad072d6d74a4ed443

    73ddf9f8fc3dc81671ea6c7600e68947

    3510cbf8b097e42745cfb6782783af2b

    694a6568b7572125305bdb4b24cebe98

    7fa5028f2394dcea02d4fdf186b3761f

    2260d015eacdc14e26be93fbc33c92aa

    d51d5e4c193617fa676154d1fe1d4802

    912dbb9e0400987c122f73e0b11876c0

    0f4cd9e8111d4eeda89dbe2ce08f6573

    d03fb3e473bd95c314987a1b166a92ed

    549a06cb43563dad994b86e8f105323a

    80149a26ee10786d6f7deaf9fb840314

    c7ced41f38b2d481d1

    3a14fbec4

    9000de7000400040004000

    9000de7000300040004000

    6d0241bc7d4a850f3067bc40124b3f52

    cdfde809746759074bcd8ba54eb19ccd

    40b5976eb7ddd1d372e34908f74ba0c4

    93c8ed2915d8a3ff7285e0aa3106073e

    2b719eeca275228fbead4c1d3016b8e4

    Exe хешей

    42aec0b84a21fa36fc26b8210c197483

    02ae44011006e358a3b1ccbd85ba01f2

    131772a1bb511f2010da66c9c7dca32f

    7860c138e3b8f40bfb6efec08f4a4068

    3bcbe4d2951987363257a0612a107101

    328aa4addb7e475c3721e2ae933

    84e7b5a60cd771173b75a775e0399bc7

    3c83b0fe45e15a2fd65ed64a8e1f65e9

    f626e64f57d3b8c840a72bbfbe9fb6ca

    fcf7a9b93cffddf0a242a8fc83845ee3

    Распакованный файл хэшей

    0988195ab961071b4aa2d7a8c8e6372d — Афродита

    Ae5f14478d5e06c1b2dc2685cbe992c1 — Jupiter

    38360115294c49538ab15b5ec3037a77 — A zorult

    Уникальные имена файлов PDF

    Автор: Donor1

    RFQ # 88556524.pdf

    ADNOC RFQ 97571784 — Покупка — основной магазин Mussafah — Tehnical and Commercial.pdf

    ALJABER-GROUP-RFQ-38982254237312018-848000071984-03-19-Rev-1.1.pdf

    Проект разработки газа Далма (Пакет B) — ТЕНДЕРНЫЙ БЮЛЛЕТЕНЬ-01.pdf

    ЗАПРОС ПОСТАВЩИКОВ ДОГОВОР НА ПОСТАВКУ НА 3 ГОДА (ПРОДЛЕНИЕ LTPA 62431092) .pdf

    Автор: г-н Адел

    ЗАПРОС ЗАПРОСА-ALJ-HPORTA.

    RFQ-РАСШИРЕНИЕ МЕЖДУНАРОДНОГО АЭРОПОРТА ХАМАД, ДОХА, КАТАР.pdf

    RFQ-ХАМАД РАСШИРЕНИЕ МЕЖДУНАРОДНОГО АЭРОПОРТА, DOHA.pdf

    RFQ # ENQ34640-ALJ24.pdf

    AJC-QA HAMAD INTERNATIONAL AIRPORT EXPANSION, DOHA.pdf

    серверов CMS /crevisoft[.ptingnet/images/backgrounds/ob/index.php

    hxxp: // nsseinc [.] com / lingo / index.php

    Адрес электронной почты

    [электронная почта защищена]

    URL-адреса, размещенные на ZIP:

    Автор PDF: Donor1

    hxxps: // мы [.] tl / t-lBcWz3Rcbs

    hxxps: // мега [.] nz / #! Ov41xapb! M-COPorpfcQ7j1G61afFVruLbDVwzNfujRIwERqlIQw

    hxxps: // we [.] tl / t-7XwI9xNjQj

    hxxps: // мы [.] tl / t-AgAdhMTWIm

    hxxps: // mega [.] nz / file / fkImWKab # zvyeMmsYgGiu-hK-FT0o4000R9wtAr4g: hK-FT0o4OBozg0r4g: ] tl / t-utJr50o6uf

    hxxp: // bit [.] ly / 32qQFah

    hxxps: // mega [.] nz / file / zsIB2aLK # pyTNpp8h5pZhpq0i7w0OB8itu3Rj_02nga9BksARD.] Пг / # nrozSBoL Pc5ApemPW46RC8b0kgiTIyuIa0MnQV9GDUPXGK8__LM

    hxxps:!. // мы [] ТЛ / т-TbbBN9VnEZ

    hxxps: // мега [] пг / # KuRElKZT 5F_FfxkyPI7tvJ-mnL7LppAU5X5wA1XbpTM-z8DpVB8

    hxxps:.! // mega [.] nz / file / q55WVIKB # zm3CTH6XEv63mwacATKpo2AMe7yjFmp-KpQXUBkhZJ4

    hxxp: // bit [.] ly / 3a3CwSX

    hxxps: // we [.] HcLM

    . ] nz / #! Tmw0EK5Q! zSLa_Ell7Ti5sz-ca-plgqc4vZM7S813Hb9Yk5Jk81Y

    hxxps: // мы [.] tl / t-0NlciPHf5y

    hxxps: // mega [.] Пг / # y6w1BAqS DMfA221sRvIyqVqPNhsKMZEAtBNkjY_jLUWEmCpxMfo

    hxxps:!. // мега [] Н.З. / # j2JSwQYb LaAP2L2WBKLU3DlR6BViQxZ4b8fsmt53Hl3RKHMfb4w

    hxxps:!. // мега [] Н.З. / файл / Ptp1CL6R # EvbG9Gh535cDmmXXyU1_l4dM3Bq9fP2B8VdjirGiK_c

    hxxps: // мы [ .] tl / t-feLBFQVV1P

    hxxps: // we [.] tl / t-ad5X6peqHj

    hxxps: // www [.] dropbox [.] com / s / cym2723azwnb364 / ADNOC% 202020% 20REQUEST% 20FOR% 20QUOTATION-REQUEST% 20FOR% 20TENDER% 20CODE% 2076384_pdf [.] Zip? Dl = 0

    hxxps: // мы [.] Tl / t-uwwupT1WNc

    hxxps: // mega [.] Пг / # K6xgGCYJ 1cJY91IlILLrGGrDVVrkbb7vNRKL9CAFD4tB9_jP8ts

    hxxps:!. // мега [] Н.З. / # yrBGmQBA EhgekpU4VUafMvfJKlNVFej1KsgxYWv1mfzCKXejjEc

    hxxps:!! // мы [] ТЛ / т-ZcyzrvcBkP

    hxxps:.. // мега [] пг / файл / GpB3VIyS # 3-tKCJ8d-y782IN0570wHMMKQ244ttzBRpUmFXh6LZQ

    hxxps: [.]! // мега Н.З. / # OvJFjQaY UBgEDtTE_Gn4B4vYrn-d7rYeO5CBMTxt83NyXQGWh0E

    hxxps: [.] // мега Н.З. / файл / G5YmjCYJ # jvqrZX2ZLXn3SAI9nzf8w6mWtxTM4_fwx7VzHdqzfqM

    hxxps : // мега [.] nz / #! zygWnKAS! 5kp8IWNec2HK-YPK2gk-hmLa416PZLtr6VpbNZediSk

    hxxps: // мега [.] Пг / # uu40wQxJ HXlLJw7KDJgqnpwCzgrnBt9vu_W1-FZlSIvn0JU5rDw

    hxxps:!. // мега [] Н.З. / # 66hWzACL _6klTwfD-JaSkwjWrKRIBqX1ghXr-SZGk1Utc2-VJPc

    hxxps:!.. ​​// WWW [] aljaber-ооо [] ком /projects/files/ALJABER-RFQ-38982254237312018-848000071984-04-23-Rev-1[.pting1[.ptingzip

    hxxps: // we [.] tl / t-cJa4jY9Egz

    hxxps: // we [.] tl / t-Out44emJ9t

    hxxps: // мы [.] tl / t-QuCLQY3cTh

    hxxps: // мы [.] tl / t-nMKuKWbMlE

    hxxps: // мега [.] nz / file / f1RTVa4A # 2uGmQV64RKkNYZEECYXFKjGPS-nalF2ZshufSgqsA_k

    hxxps: // мы [.] tl / t-oAkwGNORsR

    hxxps: // мы [.] tl / t-cFvm5QQlyV

    hxxps: // www [.] dropbox [.] com / s / 5b0bti9r6xhf3pq / ADNOC% 202020% 20 ТРЕБОВАНИЕ% % 2056774387_PDF [.] Zip? Dl = 0

    hxxps: // мы [.] Tl / t-Didobux8kG

    hxxps: // мы [.] Tl / t-FkBOHwy1ME

    hxxps: // mega [.] nz / file / u7xRlS7T # I8L3NL_zi-JizZagSF-E1Gcj5I8ednV6YdqyWs5RnNo

    hxxps: // мы [.] tl / t-XsVO5hewBu

    hxxps: автор PDF

    Автор PDF

    ] tl / t-NwSigkLd2E

    hxxps: // мы [.] tl / t-wQB6ioE8dL

    hxxps: // мы [.] tl / t-u3NL7Wnplr

    hxxps: // we [.] tl / t- zC6Wz4CpfZ

    hxxps: // мы [.] tl / t-5wQSJsFUlC

    hxxps: // мы [.] tl / t-egfvdBvESW

    hxxps: // мы [.] tl / t-2a9xxps:

    //we [.] tl/t-4BnTk2Hwiv

    hxxps: // we [.] tl / t-hSqtTJDi1f

    hxxps: // we [.] tl / t-1VyVEAtzAf

    hxxps: // we [. ] tl / t-E1iDs5Bghr

    hxxps: // мы [.] tl / t-YlbV0AIU5b

    hxxps: // мы [.] tl / t-1yLti4IfaN

    hxxps: // we [.] tl / t-dGN9sRTnch

    hxxps: // we [.] tl / t-spOqYklJIQ

    hxxps: // we [.] tl / t- cunxjPBouY

    hxxps: // we [.] tl / t-39SvbwCY2E

    hxxps: // we [.] tl / t-9RVc3dflK6

    hxxps: // we [.] tl / t-aBUV3EMdx 9000 //we [.] tl/t-XdOjUbrcK8

    hxxps: // мы [.] tl / t-MkUZugwABd

    hxxps: // мы [.] tl / t-ikxwkPtSBi

    hxxps: // we [.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.