Эм 14: Электродуговой металлизатор ЭМ-14М купить в Москве по низкой цене

Содержание

Испытываем металлизатор ЭМ-14м | Яхта Стальная Крыса

Учитывая, что идея покрыть стальной корпус цинком или алюминием и сделать его таким образом почти вечным недает покоя уже давно, не опробовать нашедшийся в закромах электродуговой металлизатор ЭМ-14м мы  не моги))  Вводные: материал основы- сталь ст3сп, наплавляемая проволока — обычная сварочная 09Г2С (алюминиевая, купленная для ТИГа не влезла по диаметру), давление подаваемого воздуха- около 6 атм., ток дуги- самый маленький который только позволил выставить полуавтомат.  Сразу скажу- судя по результату — параметры эти совсем неправильные, и нужно будет экспериментировать еще. Так сказать- первый блин. Если кто может чтото посоветовать по теме- буду признателен, ибо аппарат хороший и хочется выжать из него максимум возможного. А может он много- например, доподлинно известно, что таким пистолетом напыляют металл при восстановлении валов. А это все таки штука серьезная. Под катом- много красочных искр, а также менее красочных результатов напыления.  

2. Металлизатор ЭМ-14м в процессе напыления стали на сталь:

 

3.

 

4.

 

5.

 

6. металлизатор ЭМ-14м. Собственно это агрегат где встречаются две проволочки между которыми горит дуга, плавящая их, а продукты расплавления выдуваются вперед сжатым воздухом.Тоесть аппарату нужны две катушки проволоки, два провода от сварочного полуавтомата и шланг с сжатым воздухом:

 

7.

 

8.

 

9. металлизатор ЭМ-14м со снятым соплом

 

10.

 

11.

 

12. Перед металлизацией поверхность зачистили- сделали две зоны- просто болгаркой (грубая фактура) и болгаркой а сверху мелкозернистым шкурочным диском:

 

Результат работы металлизатора ЭМ-14м

В целом результат неудоволетворительный- покрытие в массе своей не держится- соскрябывается без усилий гвоздиком, щепкой или ногтем. Зачастую адгезия напыленных частиц между собой гораздо выше чем с подложкой- в результате напыленная корочка снимается прямо целыми чешуйками. Но скорее всего это происходит изза недостаточных силы тока и давления воздуха- надо пробовать на других режимах.

На ощупь покрытие шершавое — то что надо для нанесения грунтов.

В дальнейшем будем пробовать работать с цинковой и алюминиевой проволокой.

13.

 

14.

 

15.

 

16.

 

17. Отслоение напыленного слоя крупным планом

 

18.

 

19.

 

20. Отслоение

Новое. Ручной инструмент на интернет-аукционе Au.ru

Металлизатор ЭМ-14М используется при проведении восстановительных работ для изношенных поверхностей, и нанесения покрытий из цинка и алюминия, имеющих антикоррозийное, термоустойчивые, износоустойчивые или просто декоративные свойства. Покрытие наносится с помощью газо-термического напыления проволочного материала, который имеет температуру плавления не больше, чем 3000С. Если проволока будет более жесткая, ее необходимо отжечь. Поверхность предварительно должна быть специальным образом подготовлена, очищена от загрязнений с нарезанной или накатанной резьбой или с искусственно созданной шероховатой структурой.
Благодаря мощности металлизатора ЭМ-14М производительность процесса нанесения покрытий повышается, а временные затраты снижаются.

Технология электродуговой металлизации (ЭДМ)
ЭДМ очень популярная технология, которая обеспечивает более широкие возможности относительно других методов нанесения металлических покрытий.
Применяется для:
Восстановления деталей машин, агрегатов и оборудования, с помощью алюминиевого или цинкового напыления, с обеспечением антикоррозионных свойств.
Получение покрытий из псевдосплавов – алюминия и стали, бронзы и стали и др.
Нанесение декоративных покрытий – бронза, латунь, медь, алюминий.
Принцип дуговой механизации заключается в непрерывной подаче двух проволок, между концами которых возбуждается дуга, расплавляющая проволоку. Расправленный таким образом металл подается со струей сжатого воздуха в мелкораспыленном состоянии. Так же вместо сжатого воздуха для алюминиевых и антикорозионных напылений используется азот.

Методы обработки
Обработка проводится ручным способом, но возможна интеграция аппарата на приспособления, которые обеспечивают механизированное нанесение напыления.
Устанавливается металлизатор ЭМ-14М на суппорт вращателя, который должен обеспечить требуемое ему относительное перемещение.
Эксплуатационные параметры металлизатора ЭМ-14М – температура от -5 до +40С, влажность воздуха до 85%.

Технические характеристики Металлизатора ЭМ-14М
Номинальная производительность
по распыленному материалу кг/ч По алюминию-12,5
По цинку — 40,0
Диаметр распыляемой проволоки мм Алюминий — 1,5-2,0
Цинк — 1,5 — 2,5
Номинальная частота Гц 50/60
Рабочий ток дуги А 50-400
Рабочее напряжение дуги В 17-40
Рабочее давление сжатого воздуха МПа 0,5-0,6
Габариты мм 230x220x133
Масса кг 2,3

Электродуговой металлизатор эм-14 | Объявление на Авито

Назначение:
Металлизатор ЭМ-14 предназначен для нанесения противокоррозионных покрытий из цинка и алюминия в монтажных условиях. Аппарат может быть использован в цеховых условиях. Аппарат можно использовать при механизированном процессе напыления. В этом случае он должен быть установлен на суппорт токарного станка или другое устройство, обеспечивающее необходимое относительное перемещение металлизируемой поверхности и металлизационного аппарата. Аппарат позволяет производить работы, связанные с восстановлением изношенных поверхностей, получением жаростойких, износостойких и других покрытий, при этом допускается применять металлические материалы в виде проволоки с температурой плавления до 3000°С. Жесткую проволоку необходимо отжечь. Аппарат ЭМ-14 эксплуатируется при температуре окружающей среды от минус 5 до плюс 40°С и относительной влажности до 85%.

Устройство и принцип работы:
Металлизатор ЭМ-14 состоит из турбинного привода с индукционным регулятором скорости подачи, трехступенчатого редуктора, механизма подачи проволоки, распылительной головки и воздушного крана.
Привод турбинный обеспечивает непрерывное вращение подающих роликов механизма подачи проволоки и плавную регулировку их числа оборотов.
При подаче сжатого воздуха на лопатки рабочего колеса турбины вал турбины начинает вращаться. Скорость вращения колеса турбины может достигать 35000 об/мин.

В роторе турбины, вращающейся рядом с постоянным многополюсным магнитом, образуются индукционные токи, тормозящие его вращение.
Величина индукционных токов, а следовательно, и тормозящего момента будет зависеть от взаимного положения магнита и ротора.

Редуктор трехступенчатый. Две червячные ступени редуктора расположены в герметичном корпусе. Герметичность осуществляется со стороны турбинного привода лабиринтным уплотнением.
Двухступенчатый червячный редуктор передает вращение на третью ступень редуктора, с помощью которой осуществляется ступенчатое регулирование скорости подачи проволоки. Положение шестерен соответствует подаче проволоки со скоростями 4—12 м/мин. Чтобы получить скорость подачи проволоки 2—6 м/мин, шестерни необходимо поменять местами.
В глухих гнездах подшипников установлены вытяжные кольца с резьбой для выемки подшипников из гнезд.

Механизм подачи проволоки состоит из ведущих роликов, закрепленных на изоляционных втулках. На откидной верхней крышке закреплены на качающейся подвеске прижимные ролики. При работающем аппарате крышка должна быть закрыта и ее положение зафиксировано с помощью рукоятки. Необходимое усилие нажатия прижимных роликов на проволоку устанавливается с помощью нажимного винта, расположенного на крышке.

ЭМ 14 Электромагниты — соленоиды

телефон в Москва
8 (800) 505-10-92

Головной офис
+7(4852) 59-91-31
+7(4852) 91-05-32

Москва
+7(495) 902-65-32

сайт: www.adkom.ru

email: [email protected]

ЭМ 14 Электромагниты — соленоиды

Артикул: ЭМ 14
Цена: по запросу
Наличие: 1шт.

Электромагниты ЭМ-14 предназначены для работы в системах управления дизель генераторов.

ОСНОВНЫЕ ТЕХНИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

— Номинальное напряжение питания 12В.
— Пределы изменения питающего напряжения от 0,9 до 1,25 номинального напряжения.
— Рабочая температура окружающей среды от -50°С до +70°С.
— Степень защиты от проникновения посторонних тел и воды — IР56 ГОСТ 14254-96.
— Электромагниты для автотранспортных средств выпускаются в климатическом исполнении «УХЛ» ГОСТ 15150-69.


Тип Код ОКП Ход якоря, мм Номин. тягов. усил., не менее, Н Усил. удерж. не менее, Н Напряж. пит. номин, В Напряж. сраб., не менее, В Напряж. опуск., не менее, В Ток номин, А Продолж. вкл., ПВ%, с Мощн. номин., Вт Норма упак., шт
ЭМ 14 37 4231 0493 53 35 90 12 10.8 4 In=31
Iy=1.5
Обмотка пусковая не более 5, обмотка удерживающая 100% 18 10

Габаритный чертеж на электромагниты ЭМ 14.

Кровать двуспальная Элизабет ЭМ-14 KOM-EM14-2

Гарантия 1 год; Длина спального места, мм: 2000; Стиль: модерн; Ширина спального места, мм: 1600; Материал корпуса: ЛДСП Е1, МДФ; Компоненты, входящие в комплект: основание; Тип поверхности корпуса: матовый; Высота, мм: 800; Материал кромки: ПВХ; Производитель: Компасс-мебель; Ширина, мм: 1655; Основной цвет мебели: древесина коричневая темная орех; Цвет корпуса: орех темный; Цвет кромки: орех темный; Серия: Элизабет; Масса брутто, кг: 64.5; Размер упаковки, мм: 2050х300х60, 1670х810х50, 2010х1600х60; Объем упаковки, куб. м: 0.3; Размеры, мм: 2050x1655x800; Длина, мм: 2050



Характеристики товара, Кровать двуспальная Элизабет ЭМ-14 KOM-EM14-2


Высота, мм
800
Гарантия, месяцы
12
Длина спального места, мм
2000
Длина, мм
2050
Компоненты, входящие в комплект
основание
Масса брутто, кг
64.5
Материал корпуса
ЛДСП Е1, МДФ
Материал кромки
ПВХ
Объем упаковки, куб. м
0.3
Основной цвет мебели
древесина коричневая темная орех
Производитель
Компасс-мебель
Размер упаковки, мм
2050х300х60, 1670х810х50, 2010х1600х60
Размеры, мм
2050x1655x800
Серия
Элизабет
Стиль
модерн
Тип поверхности корпуса
матовый
Цвет корпуса
орех темный
Цвет кромки
орех темный
Ширина спального места, мм
1600
Ширина, мм
1655

Информация о технических характеристиках, комплекте поставки, стране изготовления, внешнем виде и цвете товара носит справочный характер и основывается на последних доступных к моменту публикации сведениях

Кровать Компасс Элизабет ЭМ-14 160×200 см (000989)

Металл — обычно думая о кровати, изготовленной из металла в голову приходят только односпальные модели, но сейчас очень востребованы именно двуспальные кровати, изготовленные из металла. Сегодня вас удивит разнообразие дизайна и то, как они с легкостью вписываются в любой современный интерьер. Прочные и долговечные, они придают помещению богемную нотку, но в то же время выглядят современно и минималистично.

Мягкие кровати. Кровати с обивкой в последнее время стали все больше и больше приобретать популярность. Каркас кровати этого типа обычно изготавливается из ДСП, МДФ или дерева, а затем «одевается» в текстильные материалы (обычно ткань) или кожу (натуральную или экологическую). Кровать с кожаным каркасом придает спальне изысканный вид. А разнообразие цветом, фактур и качества матерьяла, позволяет каждому найти вариант на свой вкус.

Из массива дерева – самый прочный и рекомендуемый вариант с точки зрения качества, является одним из самых дорогих вариантов. Двуспальная кровать с каркасом из массива дерева прочна, выглядит статно и поможет вам создать действительно царский интерьер или наоборот: станет органичным дополнением популярного сейчас стиля хюгге.

Как определиться с цветом и фактурой кровати?

Контраст – пожалуй самый эффектный вариант, так как данный прием придаст динамичности вашей спальной комнате. Можно сыграть на классических вариантах, а именно: белый черный, темно коричневый и светло бежевый, также стоит попробовать окрасить стены в насыщенные цвета, а в контраст этому приобрести полностью белую кровать. Все зависит от вашего воображения и вкуса.

Иным вариантом будет выбрать цвет кровати, который будет совпадать с цветом стен. Данный прием поможет создать комфортное пространство, и визуально увеличит пространство. Поэтому можете взять на вооружение данный прием, в случае если вы обладаете спальней маленьких габаритов.

Узоры на стенах – в данном случае не стоит перегружать пространство спальной комнаты. Будет уместным приобрести однотонную кровать, базовых оттенков в минималистичном стиле. Ученые выясняли, что самыми благоприятными цветами для спальни (чтобы быстрее высыпаться) считаются: синий, желтый, зеленый, серебристый и оранжевый.

Oracle Enterprise Manager Загрузок

Oracle Enterprise Manager Cloud Control 13c Release 2 Plug-in Update 1 (13.2.0.0)

Дополнительное необходимое программное обеспечение для Oracle Enterprise Manager Cloud Control 13c Release 2 Plug-in Update 1 (13.2.0.0)

После выпуска EM 13.2.0.0 Plug-in Update1 мы обновили несколько плагинов, и для установки последних обновленных плагинов вместе с EM 13.2 Plug-in Update1 загрузите плагины, перечисленные на этой странице.

Подробные инструкции по использованию этих обновленных плагинов для установки EM 13.2.0.0 Plug-in Update1 см. В Базовом руководстве по установке EM Cloud Control, доступном здесь.

Двоичные файлы

Oracle Business Intelligence Publisher (BIP) 12.1.3.0 устанавливаются вместе с Enterprise Manager Fresh 13.2.0.0 Install or Upgrade to 13.2.0.0, поэтому больше не требуется загружать и устанавливать BI Publisher отдельно.

Если Enterprise Manager должен быть настроен для обеспечения высокой доступности, см. Инструкции, доступные в Расширенном руководстве по установке и настройке здесь.См. Технический документ здесь для настройки балансировщика нагрузки.

Шаблон базы данных (с предварительно настроенным репозиторием EM 13.2.0.0) для установки Oracle Enterprise Manager Cloud Control 13c Release 2 Plug-in Update 1 (13.2.0.0)

Чтобы узнать больше о том, как использовать этот шаблон для установки EM 13.2.0.0, см. Базовое руководство по установке Enterprise Manager Cloud Control 13c, выпуск 2 (13.2.0.0), доступное здесь.

См. Матрицу сертификации Enterprise Manager, доступную на My Oracle Support

Oracle Enterprise Manager Cloud Control 13c Обновление

Для обновления EM версии 12.1.0.4, 12.1.0.5 и 13.1.0.0 для обновления модуля EM 13.2.0.0 1 нет необходимости применять какие-либо исправления для консоли перед обновлением или загружать какие-либо двоичные файлы агента 13.2.0.0 из OTN.

Если вы включили BI Publisher, см. Изменения конфигурации балансировщика нагрузки здесь (PDF).

Выпуск обновления подключаемого модуля

Post 13.2, мы обновили некоторые подключаемые модули, и если вы хотите загрузить эти подключаемые модули и использовать их как часть обновления 13.2, загрузите их с этой страницы до начала процесса обновления.

Если вы развернули какой-либо из подключаемых модулей, перечисленных на этой странице, загрузите и установите последнюю версию, совместимую с 13c, до начала процесса обновления. Подробные инструкции доступны в «Руководстве по обновлению Cloud Control» здесь.

Oracle Enterprise Manager Cloud Control Mobile

cryoSPARC: алгоритмы для быстрого неконтролируемого определения структуры крио-ЭМ

  • 1

    Кюльбрандт, В. Биохимия.Революция в разрешении. Наука 343 , 1443–1444 (2014).

    Артикул Google Scholar

  • 2

    Smith, M.T.J. & Рубинштейн, Дж. Л. Структурная биология. За пределами blob-ологии. Наука 345 , 617–619 (2014).

    CAS Статья Google Scholar

  • 3

    Liao, M., Cao, E., Julius, D. & Cheng, Y. Структура ионного канала TRPV1, определенная с помощью электронной криомикроскопии. Природа 504 , 107–112 (2013).

    CAS Статья Google Scholar

  • 4

    Bai, X.C., Fernandez, I.S., McMullan, G. & Scheres, S.H.W. Структуры рибосом с разрешением, близким к атомному, из тридцати тысяч крио-ЭМ-частиц. eLife 2 , e00461 (2013).

    Артикул Google Scholar

  • 5

    Yan, C. et al. Структура сплайсосомы дрожжей на 3.Разрешение 6 ангстрем. Наука 349 , 1182–1191 (2015).

    CAS Статья Google Scholar

  • 6

    Banerjee, S. et al. Крио-ЭМ-структура человеческого p97 с разрешением 2.3 Å и механизм аллостерического ингибирования. Наука 351 , 871–875 (2016).

    CAS Статья Google Scholar

  • 7

    Sirohi, D. et al. 3.Крио-ЭМ структура вируса Зика с разрешением 8 Å. Наука 352 , 467–470 (2016).

    CAS Статья Google Scholar

  • 8

    Abeyrathne, P.D., Koh, C.S., Grant, T., Grigorieff, N. & Korostelev, A.A. Ансамбль крио-ЭМ раскрывает транслокацию вирусного IRES через рибосому, похожую на червя. eLife 5 , e14874 (2016).

    Артикул Google Scholar

  • 9

    Киманиус, Д., Форсберг, Б.О., Шерес, С. И Линдал, Э. Ускоренное определение крио-ЭМ структуры с распараллеливанием с использованием графических процессоров в RELION-2. eLife 5 , e18722 (2016).

    Артикул Google Scholar

  • 10

    Хендерсон Р. Избегая ловушек криоэлектронной микроскопии одиночных частиц: Эйнштейн от шума. Proc. Natl. Акад. Sci. США 110 , 18037–18041 (2013).

    CAS Статья Google Scholar

  • 11

    Хендерсон Р.и другие. Итоги первого заседания рабочей группы по валидации электронной микроскопии. Структура 20 , 205–214 (2012).

    CAS Статья Google Scholar

  • 12

    Scheres, S.H.W. Байесовский взгляд на определение крио-ЭМ структуры. J. Mol. Биол. 415 , 406–418 (2012).

    CAS Статья Google Scholar

  • 13

    Григорьев Н.FREALIGN: уточнение структур одиночных частиц с высоким разрешением. J. Struct. Биол. 157 , 117–125 (2007).

    CAS Статья Google Scholar

  • 14

    Чжан, К. Gctf: определение и коррекция CTF в реальном времени. J. Struct. Биол. 193 , 1–12 (2016).

    CAS Статья Google Scholar

  • 15

    Хоанг Т.В., Кэвин, X., Шульц, П., Ричи, Д. gEMpicker: высокопараллельный инструмент для сбора частиц с ускорением на GPU для криоэлектронной микроскопии. BMC Struct. Биол. 13 , 25 (2013).

    Артикул Google Scholar

  • 16

    Мур, G.E. Прогресс в цифровой интегрированной электронике. В Proc. Int. Избрать. Устройства соответствуют 11–13 (IEEE, 1975).

  • 17

    Sigworth, F.J. Подход максимального правдоподобия к уточнению одночастичных изображений. J. Struct. Биол. 122 , 328–339 (1998).

    CAS Статья Google Scholar

  • 18

    Nocedal, J. & Wright, S.J. Численная оптимизация (Springer, 2000).

  • 19

    Calafiore, G.C. И Эль-Гауи, Л. Модели оптимизации (Издательство Кембриджского университета, 2014).

  • 20

    Ботту Л. Крупномасштабное машинное обучение со стохастическим градиентным спуском.В Proc. COMPSTAT’2010 (ред. Лешевалье Й. и Сапорта Г.) 177–186 (2010).

  • 21

    Крижевский А., Суцкевер И. и Хинтон Г. В Adv. Neural Inf. Процесс. Syst. (ред. Pereira, F., Burges, C.J.C. et al.) 1–9 (NIPS, 2012).

  • 22

    Тайгман Ю., Янг М., Ранзато М. и Вольф Л. В Proc. IEEE Comput. Soc. Конф. Comput. Vis. Распознавание образов. (ред. Дикинсон, С. и др.) 1701–1708 (IEEE Computer Society, 2014).

  • 23

    Schep, D.G., Zhao, J. & Rubinstein, J.L. Моделирование субъединиц α-субъединиц Thermus thermophilus V / A-ATPase и Saccharomyces cerevisiae V-ATPase ферментов с помощью крио-EM и эволюционной ковариантности. Proc. Natl. Акад. Sci. США 113 , 3245–3250 (2016).

    CAS Статья Google Scholar

  • 24

    Чжао, Дж., Бенлекбир, С. и Рубинштейн, Дж. Л. Наблюдение с помощью электронной криомикроскопии вращательных состояний в эукариотической V-АТФазе. Природа 521 , 241–245 (2015).

    CAS Статья Google Scholar

  • 25

    Кирфотт, Р. Б. Строгий глобальный поиск: постоянные проблемы (Springer, 2014).

  • 26

    Little, J.D.C., Karel, C., Murty, K.G. И Суини, Д. Алгоритм задачи коммивояжера. Опер. Res. 11 , 972–989 (1963).

    Артикул Google Scholar

  • 27

    Ян Дж., Ли, Х. и Цзя, Й. Go-ICP: эффективное и глобальное решение 3D-регистрации. В Proc. IEEE Int. Конф. Comput. Vis. (ред. Дэвис, Л. и Хартли, Р.) 1457–1464 (IEEE, 2013).

  • 28

    Campbell, M.G., Veesler, D., Cheng, A., Potter, C.S. & Carragher, B. Реконструкция протеасомы термоплазмы Acidophilum 20S с разрешением 2,8 Å с использованием криоэлектронной микроскопии. eLife 4 , e06380 (2015).

    Артикул Google Scholar

  • 29

    Вонг, В.и другие. Крио-ЭМ структура рибосомы Plasmodium falciparum 80S, связанная с антипротозойным препаратом эметином. eLife 3 , 1–20 (2014).

    Артикул Google Scholar

  • 30

    Scheres, S.H.W. И Чен, С. Предотвращение переобучения при определении крио-ЭМ структуры. Nat. Методы 9 , 853–854 (2012).

    CAS Статья Google Scholar

  • 31

    Розенталь, П.Б. и Хендерсон Р. Оптимальное определение ориентации частиц, абсолютной руки и потери контраста при одночастичной электронной криомикроскопии. J. Mol. Биол. 333 , 721–745 (2003).

    CAS Статья Google Scholar

  • 32

    Chen, S. et al. Замена шума с высоким разрешением для измерения переобучения и проверки разрешения при определении трехмерной структуры с помощью электронной криомикроскопии одиночных частиц. Ультрамикроскопия 135 , 24–35 (2013).

    CAS Статья Google Scholar

  • 33

    Янь, Х., Кардоне, Г., Чжан, Х., Чжоу, З.Х. И Бейкер, Т. Анализ отдельных частиц в сочетании с микроскопией: высокопроизводительный подход к реконструкции икосаэдрических частиц. J. Struct. Биол. 186 , 8–18 (2014).

    CAS Статья Google Scholar

  • 34

    Murray, S.C. et al.Проверка крио-ЭМ структуры канала IP3R1. Структура 21 , 900–909 (2013).

    CAS Статья Google Scholar

  • 35

    Radermacher, M., Wagenknecht, T., Verschoor, A. & Frank, J. Трехмерная реконструкция из серии случайных конических наклонов с одной экспозицией, примененной к 50S рибосомной субъединице Escherichia coli . J. Microsc. 146 , 113–136 (1987).

    CAS Статья Google Scholar

  • 36

    Leschziner, A.E. & Nogales, E. Метод реконструкции с ортогональным наклоном: подход к созданию одноклассовых объемов без отсутствующего конуса для реконструкции асимметричных частиц ab initio . J. Struct. Биол. 153 , 284–299 (2006).

    Артикул Google Scholar

  • 37

    Penczek, P.A. & Asturias, F.J. Ab initio определение криоЭМ структуры как проблема валидации. В Proc. IEEE Int. Конф. по процессу изображения. (ред. Песке-Попеску, Б. и Фаулер, Дж.) 2090–2094 (IEEE, 2014).

  • 38

    Sorzano, C.O.S. и другие. Статистический подход к проблеме начального объема в анализе отдельных частиц с помощью электронной микроскопии. J. Struct. Биол. 189 , 213–219 (2015).

    CAS Статья Google Scholar

  • 39

    Джайтли, Н., Брубакер, М.А., Рубинштейн, Дж.Л. и Лилиен, Р.Х. Байесовский метод вывода трехмерной структуры макромолекул с использованием средних по классу изображений из электронной микроскопии одиночных частиц. Биоинформатика 26 , 2406–2415 (2010).

    CAS Статья Google Scholar

  • 40

    Элмлунд, Д. и Элмлунд, Х. SIMPLE: Программное обеспечение для ab initio реконструкции гетерогенных одиночных частиц. J. Struct. Биол. 180 , 420–427 (2012).

    Артикул Google Scholar

  • 41

    Элмлунд, Х., Элмлунд, Д. и Бенджио, С. ПРАЙМ: создание вероятностной начальной трехмерной модели для криоэлектронной микроскопии одиночных частиц. Структура 21 , 1299–1306 (2013).

    CAS Статья Google Scholar

  • 42

    Брубейкер, М.А., Пунджани, А. и Флит, Д.Дж. Создание белков за день: эффективная трехмерная молекулярная реконструкция.В Proc. IEEE Comp. Soc. Конф. на вычисл. Vis. Pattern Rec. (ред. Бишоф, Х. и др.) (IEEE, 2015).

  • 43

    Dvornek, N.C., Sigworth, F.J. & Tagare, H.D. SubspaceEM: быстрый апостериорный алгоритм для крио-ЭМ реконструкции одиночных частиц. J. Struct. Биол. 190 , 200–214 (2015).

    CAS Статья Google Scholar

  • 44

    Cianfrocco, M.A. & Leschziner, A.E. Низкая стоимость, высокая производительность обработки данных криоэлектронной микроскопии одиночных частиц в облаке. eLife 4 , e06664 (2015).

    Артикул Google Scholar

  • 45

    Бай, X.-C., Rajendra, E., Yang, G., Shi, Y. & Scheres, S.H. Отбор образцов конформационного пространства каталитической субъединицы γ-секретазы человека. eLife 4 , e11182 (2015).

    Артикул Google Scholar

  • 46

    Рубинштейн, Дж.Л. и Брубакер, М.А. Выравнивание крио-ЭМ фильмов отдельных частиц путем оптимизации переводов изображений. J. Struct. Биол. 192 , 188–195 (2015).

    Артикул Google Scholar

  • 47

    Grant, T. и Grigorieff, N. Измерение оптимальной экспозиции для крио-ЭМ одиночных частиц с использованием реконструкции ротавируса VP6 на 2,6 Å. eLife 4 , e06980 (2015).

    Артикул Google Scholar

  • 48

    Пунджани, А., Рубинштейн, Дж., Флит, Д. и Брубейкер, М. Протокол для быстрого неконтролируемого определения крио-ЭМ структуры с использованием программного обеспечения cryoSPARC. Протокол обмена http://dx.doi.org/10.1038/protex.2017.009 (2016).

  • 49

    Юдин, А., Корир, П.К., Салаверт-Торрес, Дж., Клейвегт, Г.Дж. & Патвардхан, A. EMPIAR: общедоступный архив необработанных данных изображений электронной микроскопии. Nat. Методы 13 , 387–388 (2016).

    CAS Статья Google Scholar

  • 50

    Суцкевер, И., Мартенс, Дж., Даль, Г. И Хинтон, Г. О важности инициализации и импульса в глубоком обучении. J. Mach. Учить. Res. 28 , 1139–1147 (2013).

    Google Scholar

  • Mobil Polyrex ™ EM Series

    Смазка для подшипников электродвигателей

    Описание продукта

    Смазки серии Super-premium Mobil Polyrex ™ EM специально разработаны для подшипников электродвигателей.Усовершенствованный состав загустителя и запатентованные технологии производства обеспечивают улучшенные характеристики подшипников и защиту для длительного срока службы электродвигателя.

    Особенности и преимущества

    Mobil Polyrex EM и Mobil Polyrex EM 103 обладают следующими функциями и преимуществами:

    Характеристики

    Преимущества и потенциальные выгоды

    Превосходный срок службы смазки

    Превосходная долговечная высокотемпературная смазка шариковых и роликовых подшипников, особенно в герметизированных на весь срок службы

    Усовершенствованный загуститель на основе полимочевины

    Повышенная долговечность по сравнению с обычными полимочевинными смазками при воздействии механических усилий сдвига

    Отличная коррозионная стойкость

    Mobil Polyrex EM и Mobil Polyrex EM 103 обеспечивают защиту от ржавчины и коррозии.Mobil Polyrex EM обеспечивает дополнительную защиту при мягкой стирке в соленой воде по сравнению с Polyrex EM 103

    .

    Малошумящие свойства

    Mobil Polyrex EM подходит для смазки шариковых подшипников во многих областях, чувствительных к шуму.

    Приложения

    Смазки Mobil Polyrex EM рекомендуются многими крупными производителями подшипников и электродвигателей для долговечной смазки шариковых и роликовых подшипников электродвигателей.

    Mobil Polyrex EM 103 более конкретно рекомендуется для таких применений, как вертикально установленные подшипники или очень большие двигатели, где OEM может потребовать более густую консистенцию смазки.

    Смазки

    Mobil Polyrex EM продемонстрировали совместимость с рядом консистентных смазок ExxonMobil на основе литиевого комплекса, а также с конкурирующими продуктами из минеральной полимочевины для электродвигателей, как это определено в соответствии с методологией ASTM D6185. По конкретным вопросам о совместимости смазок обращайтесь к своему представителю Mobil.

    Ключевые приложения:

    • Подшипники электродвигателя

    • Подшипники лопастного вентилятора

    • Подшипники высокотемпературных насосов

    • Шариковые подшипники с заводской заливкой и долговечным уплотнением

    • Шариковые или роликовые подшипники, работающие при высоких температурах, когда требуется низкое отделение масла

    • Mobil Polyrex EM для шариковых или роликовых подшипников, работающих в чувствительных к шуму средах

    Технические характеристики и разрешения

    Этот продукт превосходит следующие требования или соответствует им:

    МОБИЛ ПОЛИРЕКС ЭМ

    DIN 51825: 2004-06 — K 2 P -20

    Х

    Свойства и характеристики

    Имущество

    МОБИЛ ПОЛИРЕКС ЭМ

    МОБИЛ ПОЛИРЕКС EM 103

    Оценка

    NLGI 2

    NLGI 3

    Тип загустителя

    Полимочевина

    Полимочевина

    Цвет, Визуальный

    Синий

    Синий

    Коррозия медной ленты, 24 ч, 100 ° C, номинальное значение, ASTM D4048

    1A

    1A

    Антикоррозионные свойства, рейтинг, ASTM D1743

    ПАСС

    ПАСС

    Температура каплепадения, ° C, ASTM D2265

    260

    270

    Испытание на четырехшариковый износ, диаметр рубца, мм, ASTM D2266

    0.41

    0,6

    Испытание на четырехшариковый износ, диаметр рубца, 40 кг, 1200 об / мин, 1 ч, 75 ° C, мм, ASTM D2266

    0,41

    Низкотемпературный крутящий момент, ход, -29 C, г-см, ASTM D1478

    800

    1000

    Низкотемпературный крутящий момент, пуск, -29 C, г-см, ASTM D1478

    7500

    9300

    Срок службы смазки при 177 ° C, ч, ASTM D3336

    750+

    750+

    Маслоотделение, мас.%, ASTM D1742

    0.5

    0,1

    Пенетрация, 60X, 0,1 мм, ASTM D217

    285

    250

    Пенетрация, изменение от 60X до 100,000X, 0,1 мм, ASTM D217

    40

    40

    SKF Emcor Rust Test, 10% синтетическая морская вода, ASTM D6138

    0.1

    Вязкость при 100 C, базовое масло, мм2 / с, ASTM D445

    12,2

    12,2

    Вязкость при 40 C, базовое масло, мм2 / с, ASTM D445

    115

    115

    Индекс вязкости, ASTM D2270

    95

    95

    Вымывание водой, потери при 79 ° C, мас.%, ASTM D1264

    1.9

    0,8

    Здоровье и безопасность

    Рекомендации по охране здоровья и безопасности для этого продукта можно найти в Паспорте безопасности материала (MSDS) @ http://www.msds.exxonmobil.com/psims/psims.aspx

    Приблизительное преобразование точек в пиксели

    Приблизительное преобразование точек в пиксели

    (и Ems и%)

    Вот диаграмма, которая преобразует точки в пиксели (и ems, и%).Это приблизительное значение, которое будет зависеть от шрифта, браузера и ОС, но это хорошая отправная точка.

    Очки пикселей Ems процентов
    6 точек 8px 0.5em 50%
    7 точек 9px 0,55 эм 55%
    7.5pt 10px 0,625em 62,5%
    8pt 11px 0.7em 70%
    9 пунктов 12px 0,75em 75%
    10 точек 13 пикселей 0.8em 80%
    10.5pt 14px 0,875em 87,5%
    11 точек 15 пикселей 0.95em 95%
    12 точек 16 пикселей 1em 100%
    13 точек 17px 1.05em 105%
    13.5pt 18px 1,125em 112,5%
    14 точек 19px 1.2em 120%
    14.5pt 20 пикселей 1.25em 125%
    15 точек 21px 1.3em 130%
    16 точек 22px 1.4em 140%
    17pt 23px 1.45em ​​ 145%
    18pt 24 пикс. 1.5em 150%
    20 пунктов 26px 1.6em 160%
    22 точки 29px 1.8em 180%
    24pt 32px 2em 200%
    26pt 35px 2.2em 220%
    27pt 36px 2.25em 225%
    28pt 37px 2.3em 230%
    29pt 38px 2.35em 235%
    30 точек 40 пикселей 2.45em 245%
    32pt 42px 2.55em 255%
    34pt 45px 2,75 em 275%
    36pt 48px 3em 300%

    Округ Бастроп, Техас

    Где я могу получить информацию или задать вопросы?

    См. Информация о коронавирусе округа Бастроп, страница

    https: // www.co.bastrop.tx.us/page/em.coronavirus

    ПАНЕЛЬ

    «Панель управления» с текущими счетчиками, которые обновляются раз в неделю в понедельник вечером, также находится на этой странице. Чтобы увидеть дополнительную информацию, нажмите ссылку прямо под панелью управления.

    Обратите внимание, что панель управления изменилась в связи с изменениями информации, полученной от Департамента государственного здравоохранения (DSHS). Для ежедневных обновлений, пожалуйста, посетите панель управления DSHS.

    Информация поступает в Управление здравоохранения от Департамента здравоохранения штата Техас (DSHS) и отправляется для обновления на информационной панели. Из-за законов HIPAA люди, которые публикуют информацию, не знают больше информации.

    ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАНЕЛИ

    • * Подтвержденные случаи — активные заразные инфекции, обнаруженные с помощью молекулярных тестов. В начале пандемии COVID-19 это был единственный способ определить активные случаи.
    • * Вероятные случаи — вероятные случаи подсчитываются тремя различными способами:
    1.Активная инфекционная инфекция выявляется с помощью тестов на антигены.
    2. Имеет клинические симптомы и подвергся воздействию.
    3. Отвечает критериям записи актов гражданского состояния, таким как причина смерти или способствование смерти.
    • Смертельные случаи — в свидетельстве о смерти указана значимая причина смерти или основная причина смерти.
    • Активные случаи — оцениваются на основе количества людей, которые все еще считаются заразными.
    • Вылеченные случаи — оцениваются на основе числа людей, у которых после подтверждения на COVID-19 был получен отрицательный тест или они достигли 14-дневный карантин.
    Департамент здравоохранения штата разработал вопрос «Что такое вероятный случай COVID-19?» видео с определениями на приборной панели. Щелкните здесь, чтобы просмотреть.

    ТЕНДЕНЦИИ В ТЕХАСЕ И ОТДЕЛЬНЫХ СТРАНАХ

    См. ДАННУЮ ПАНЕЛЬЮ Департамента здравоохранения штата Техас (DSHS).

    БОЛЬНИЦЫ, ПРИЕМЫ ОИТ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ВЕНТИЛЯТОРОВ

    Штат разделен на 22 зоны обслуживания травм (TSA), обозначенных от A до V, и находится под надзором DSHS.Наш район Центрального Техаса — TSA O и включает 11 округов: Сан-Саба, Ллано, Бернет, Бланко, Уильямсон, Трэвис, Хейс, Ли, Бастроп, Колдуэлл и Фейетт. Информацию о наличии больничной койки, койки отделения интенсивной терапии и аппарата ИВЛ TSA можно найти на панели управления DSHS.

    ЧТО ЯВЛЯЕТСЯ ИСТОЧНИКОМ ИНФОРМАЦИИ В ЧАСТО ЗАДАВАЕМЫХ ВОПРОСАХ?

    Ответы, собранные в разделе «Часто задаваемые вопросы», взяты из различных источников, включая Центры по контролю и профилактике заболеваний (CDC), Белый дом, Департамент здравоохранения штата Техас (DSHS), Верховный суд Техаса, Офис губернатора Эбботта, Бастроп Управление здравоохранения округа, округ Бастроп, офис судьи округа Бастроп Пол Пейп, город Бастроп, город Элгин, город Смитвилл, Торговая палата Бастроп, Торговая палата Элгина, Торговая палата района Смитвилл, Бастроп ISD , Elgin ISD, McDade ISD и Smithville ISD.

    Эта информация быстро меняется в ответ на решения, принятые вышеупомянутыми организациями.

    Вся информация предназначена для того, чтобы помочь гражданам округа Бастроп лучше понять COVID-19, меры предосторожности, которые необходимо принять для обеспечения здоровья и безопасности, а также то, как соответствующие нормативные акты влияют на них.

    ЧТО Я МОГУ ДЕЛАТЬ ЕЖЕДНЕВНО, ЧТОБЫ ПОСТАВИТЬ ТЕХАС ОТКРЫТОМ?

    • Мойте руки
    • Социальное расстояние не менее 6 футов от других
    • Носите лицо, закрывающее лицо, окружающее людей, не входящих в вашу семью
    • Оставайтесь дома, когда вы больны

    Что такое COVID-19?

    О COVID-19

    https: // www.co.bastrop.tx.us/page/em.coronavirus

    · Чтобы узнать больше, перейдите онлайн по адресу: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-nCoV/index.html

    КАКОВЫ СИМПТОМЫ COVID-19?

    Коронавирус COVID-19 официально известен как SARS-CoV-2.

    Пациенты с коронавирусом могут столкнуться с самыми разными проблемами — от легких симптомов до тяжелого заболевания. Эти симптомы обычно появляются через 2-14 дней после контакта с вирусом. Исследования показывают, что пациенты могут быть наиболее заразными в те дни, когда у них начали проявляться симптомы.

    Пожилые люди и люди с тяжелыми сопутствующими заболеваниями, такими как болезни сердца или легких или диабет, по-видимому, подвержены более высокому риску развития более серьезных осложнений от болезни COVID-19.

    Центры по контролю и профилактике заболеваний (CDC) обновили список возможных симптомов, включив в него следующее:

    • Лихорадка
    • Кашель
    • Одышка или затрудненное дыхание
    • Озноб, многократная встряска с ознобом
    • Мышечные боли
    • Головная боль
    • Боль в горле
    • Заложенность или насморк
    • Тошнота или рвота
    • Диарея
    • Новая потеря вкуса или запаха

    Этот список не включает все возможные симптомы.CDC продолжит обновлять этот список по мере того, как узнает больше о COVID-19. Посетите веб-сайт CDC.

    Я ДУМАЮ, ЧТО У МЕНЯ COVID-19, НО Я НЕ ВИДЕЛ ВРАЧА. ЧТО МНЕ ТЕПЕРЬ ДЕЛАТЬ?

    • Оставайтесь дома, если вы заболели или думаете, что заболели.
    • Не ходите в магазин или на улицу.
    • Постарайтесь изолировать себя от членов своей семьи.
    • * Если это чрезвычайная ситуация, например, затрудненное дыхание, постоянная боль или давление в груди, новое замешательство или невозможность пробудиться, посинение губ или лица или другие серьезные симптомы, немедленно звоните 9-1-1.Если возможно, сообщите оператору, что, по вашему мнению, у вас COVID-19, и накройте лицо маской до прибытия медицинской помощи.
    • Позвоните в офис вашего лечащего врача перед визитом.

    Для получения быстрых результатов через 1 час (экспресс-тест) Пожалуйста, подождите не менее 4 дней после контакта, чтобы пройти тестирование. Большинство местных аптек, врачебных кабинетов и больниц теперь предлагают экспресс-тесты. Это лишь некоторые из местных.


    o Отделение неотложной помощи Ally по телефону 512-321-0911, чтобы назначить время приема.За этот тест взимается плата, но они имеют страховку. Пожалуйста, подождите не менее 4 дней с момента контакта, прежде чем искать тест. Пациенты с симптомами будут иметь приоритет над пациентами без них.

    o FastMed Urgent Care по телефону 512-332-2273, чтобы назначить время приема. За этот тест взимается плата, но они имеют страховку. Пациенты с симптомами будут иметь приоритет над пациентами без них. Щелкните здесь, чтобы назначить встречу.


    o Аптека CVS 512-308-0234 Требуется запись. Можно установить по телефону или подключившись к Интернету.Ограниченные поставки. Щелкните здесь, чтобы назначить встречу.

    МОЙ ДОКТОР СКАЗАЛ МНЕ, ОН ДУМАЕТ, ЧТО У МЕНЯ COVID-19, НО Я НЕ СДАЛСЯ НА ТЕСТ. ЧТО ДЕЛАТЬ СЕЙЧАС?

    • Иди к себе домой и оставайся там. Теперь вы находитесь под обязательной самоизоляцией как минимум на 7-10 дней или до тех пор, пока врач не освободит вас.
    • Все, кто живет в вашей семье, также находятся под обязательным периодом самоизоляции минимум 7-10 дней.
    • Вам и другим членам вашей семьи запрещается ходить на работу, в школу, детский сад, на общественные или религиозные собрания, за покупками или на любые другие общественные мероприятия до тех пор, пока врач не освободит вас.

    Какие передовые методы избежать COVID-19?

    Лучшее способ защитить себя и свою семью — принять следующие профилактические действия по предотвращению заражения:

    • Часто мойте руки водой с мылом в течение не менее 20 секунд.Если мыло и вода недоступны, используйте дезинфицирующее средство для рук на спиртовой основе.
    • Не прикасайтесь к глазам, носу и рту немытыми руками.
    • Избегайте близких контактов с людьми, не являющимися членами вашей семьи.
    • Оставайтесь дома, когда вы заболели.
    • Прикрывайте рот салфеткой при кашле или чихании, а затем выбросьте салфетку в мусор.
    • Очищайте и дезинфицируйте предметы и поверхности, к которым часто прикасаются.
    • Носите маску для лица, когда находитесь в общественных местах или рядом с людьми, не являющимися членами вашей семьи.

    Как добраться до округа Бастроп Управление по чрезвычайным ситуациям?

    Подробнее информация и официальные обновления:

    · Сайт

    o https://www.co.bastrop.tx.us/page/em.coronavirus

    · Facebook

    o Управление по чрезвычайным ситуациям округа Бастроп

    · Twitter

    о @BastropCntyOEM

    Крио-EM структура кишечного аденовируса HAdV-F41 подчеркивает структурные вариации аденовирусов человека

    ВВЕДЕНИЕ

    Аденовирусы (AdV) — это патогены, которые могут быть сконструированы для использования в качестве терапевтических инструментов ( 1 , 2 ).К настоящему времени описано более 100 типов AdVs человека (HAdV) (http://hadvwg.gmu.edu/; https://talk.ictvonline.org/) и сгруппированы по семи видам (от HAdV-A до HAdV- Г). HAdV вызывают острые инфекции дыхательных путей и желудочно-кишечного тракта, а также конъюнктивит. Большинство инфекций AdV носят субклинический характер, но они могут вызывать значительную заболеваемость и даже смертность у пациентов с ослабленным иммунитетом ( 3 ). В настоящее время нет вакцин для использования среди населения в целом (хотя некоторые из них доступны для U.S. военный персонал) или одобренные противовирусные препараты для лечения AdV-инфекций.

    Структуры высокого разрешения (от 3,2 до 3,5 Å) доступны только для двух HAdV: HAdV-C5 и HAdV-D26 ( 4 6 ). Капсид AdV выделяется среди вирусов без оболочки своим большим размером (~ 950 Å, 150 МДа), числом триангуляции (псевдо- T = 25) и сложным составом. Грани образованы 240 тримерными гексонами, а пентамеры базового белка пентона заполняют вершины.Связывающие рецептор тримерные волокна различной длины, в зависимости от типа вируса, выступают из оснований пентона ( 7 ). Второстепенные белки оболочки IIIa и VIII на внутренней поверхности капсида и IX на внешней, способствуют модуляции квазиэквивалентных икосаэдрических взаимодействий. Мембранный литический белок VI конкурирует с геном-конденсирующим белком VII за связывание с внутренней полостью в гексонах ( 5 , 8 ).

    HAdV у видов F необычны тем, что имеют узкий энтеральный тропизм.HAdV-F40 и HAdV-F41 вместе с рота- и норовирусами являются одной из трех основных причин вирусного гастроэнтерита у детей раннего возраста ( 9 , 10 ). На их долю приходится более половины AdV, выявленных в стуле у иммунокомпетентных детей с симптомами ( 11 13 ). Различия в структуре капсида HAdV-F по сравнению с HAdV-C могут придавать стабильность желудочным условиям на пути к кишечнику in vivo. Анализы на инфекционность после инкубации в кислых условиях показали, что HAdV-F41 стабилен и даже, возможно, активирован при низком pH, в отличие от HAdV-C5 ( 14 ).Тот факт, что вирусы HAdV-F кодируют два разных волокна, связан с их кишечным тропизмом, хотя точное соотношение неясно ( 15 , 16 ). Длинное волокно связывается с белком рецептора Коксаки и AdV (CAR), как отдельные волокна многих других неинтеральных видов AdV ( 17 ), но для короткого волокна рецептор не был идентифицирован. Однако псевдотипирование HAdV-C5 коротким волокном HAdV-F40 привело к устойчивости к инактивации в кислых условиях и способности вызывать инфекцию в кишечнике после перорального или ректального введения ( 18 ).

    Здесь мы используем криоэлектронную микроскопию (крио-ЭМ), чтобы получить структуру вириона HAdV-F41 и сравнить ее с двумя другими известными структурами HAdV. Мы интерпретируем структурные различия в контексте высокой физико-химической стабильности кишечного капсида AdV.

    РЕЗУЛЬТАТЫ

    Физико-химическая стабильность вирионов HAdV-F41

    Для оценки стабильности вирионов HAdV-F41 мы оценили их инфекционность после обработки синтетическими желудочными, кишечными или желудочными жидкостями с последующим введением кишечных жидкостей.Флуоресценцию зеленого флуоресцентного белка (GFP), измеренную с помощью проточной цитометрии, использовали для определения количества инфицированных клеток в культурах 293 эмбриональной почки человека (HEK). Ни желудочные, ни кишечные заболевания не снижали инфекционность. Последовательная инкубация в синтетической желудочной и кишечной жидкости привела к явному увеличению экспрессии GFP, что указывает на повышенную инфекционность (рис. S1A). То есть HAdV-F41 не только устойчив к кислому pH, как было показано ранее ( 14 ), но также активируется за счет комбинированного действия подкисления, соли и протеаз, обнаруживаемых при последовательном лечении желудка и кишечника.

    Мы также исследовали физическую стабильность частиц HAdV-F41 по сравнению с HAdV-C5, используя внешнюю флуоресценцию ДНК-интеркалирующего агента YOYO-1 для характеристики разрушения капсида как функции температуры. Эмиссия флуоресценции YOYO-1 увеличивалась с повышением температуры для обоих образцов, поскольку геномы подвергались воздействию растворителя (рис. S1B). В то время как температура полуперехода ( T 0,5 ), оцененная для HAdV-C5, составляла 47 ° C ( 8 ), для HAdV-F41 максимальная скорость воздействия ДНК наблюдалась при 51 ° C.Этот результат показывает, что частицы HAdV-F41 термически более стабильны, чем HAdV-C5.

    Общая структура HAdV-F41

    Крио-ЭМ карта HAdV-F41 с разрешением 4,0 Å (рис. 1, рис. S2 и таблица S1) показывает общие характеристики, общие для всех предыдущих структур AdV: a ~ 950 -A-диаметр псевдо T = 25 икосаэдрических частиц с 12 тримерными гексоновыми капсомерами на грань плюс пентамерные пентоны в вершинах. N-конец белка IX лежит на внешней поверхности капсида в углублениях, образованных тримерами гексона (рис.1Б, вверху). Второстепенные белки оболочки IIIa и VIII, а также небольшие фрагменты VI и корового белка VII можно наблюдать на внутренней поверхности икосаэдрической оболочки, ориентированной к сердцевине вириона (рис. 1B, внизу). Из-за их гибкости и несоответствия симметрии основанию пентона волокна не могут быть разрешены крио-ЭМ при наложении икосаэдрической симметрии, как это сделано здесь.

    Рис. 1 Крио-ЭМ-структура HAdV-F41 при 4,0 Å.

    ( A ) Рендеринг радиально окрашенной поверхности карты HAdV-F41 при просмотре вниз по двойной икосаэдрической оси.Одна грань обозначена белым треугольником. Оси симметрии икосаэдра обозначены белыми символами: пятеричная (пятиугольник), тройная (треугольник) и двойная (овал). К карте применен фильтр Гаусса, чтобы выделить основные особенности. ( B ) Молекулярные модели основных и второстепенных белков оболочки, прослеженные в икосаэдрической грани HAdV-F41. Вверху: вид снаружи капсида. Внизу: вид внутри капсида. Цвета протеина, как указано в легенде слева. Четыре тримеры гексона в асимметричной единице (AU) пронумерованы от h2 до h5.( C ) Рисунок, изображающий икосаэдрическую АС и окружающие гексоны, если смотреть снаружи капсида. Оси симметрии икосаэдра обозначены красными закрашенными символами. Полый красный треугольник указывает ось L3 между гексонами 2, 3 и 4.

    За исключением белков VI и VIII, структурные полипептиды HAdV-F41 короче, чем их аналоги HAdV-C5 (таблица S2). Идентичность последовательностей колеблется от 52 до 78%. Предсказанные изоэлектрические точки для гексона и пентонного основания предполагают более основную поверхность капсида для HAdV-F41 ( 14 ), за исключением вклада внешнего цементирующего белка IX, который значительно более кислый (таблица S2).На внутренней поверхности капсида белки IIIa, VI и VIII более кислые в кишечном AdV.

    Главный белок оболочки: Hexon

    Архитектура гексона HAdV-F41 очень похожа на архитектуру HAdV-C5 (рис. 2A и таблица S2) ( 5 ). Двойной желеобразный валик в каждом мономере, который образует псевдогексагональное основание тримеров, является высококонсервативным. Как и ожидалось ( 19 ), основные различия между структурами заключаются в петлях, расположенных в гексоновых башнях, так называемых гипервариабельных областях (HVR), которые представляют собой серотип-специфические эпитопы, экспонируемые на поверхности вириона (рис.2, A и B, и таблица S3). Как и в HAdV-C5, HVR в HAdV-F41 являются гибкими (дополнительный текст и рис. S3A), но мы смогли полностью отследить их все, кроме HVR4 (рис. 2, A и B, и таблица S4). Кислая петля из 32 остатков в HVR1, уникальная для HAdVs у вида C ( 20 ), не прослеживается ни в одной из доступных гексонных структур HAdV-C. Нам удалось полностью отследить HVR1 в HAdV-F41, вероятно, потому, что его более короткая длина ограничивает гибкость (рис. 2B и таблица S3). Остаток Tyr 784 также имеет среднеквадратичное отклонение (RMSD)> 2 Å между HAdV-C5 и HAdV-F41 и может участвовать в различных взаимодействиях с белком IX (см. Раздел «Неупорядоченная плотность для белка IX» ниже. ).Помимо HVR, другие области, уже описанные для HAdV-C5 и HAdV-D26, также демонстрируют изменчивость среди 12 гексоновых мономеров в икосаэдрической асимметричной единице (AU) в HAdV-F41 (дополнительный текст и рис. S3A).

    Рис. 2 Гексонная и пентонная базовые конструкции.

    ( A ) Суперпозиция гексоновых мономеров HAdV-C5 [идентификатор банка данных (PDB): 6B1T, цепь A, голубой] и HAdV-F41, окрашенных среднеквадратичным отклонением (RMSD). Остатки, превышающие пороговое значение среднеквадратичного отклонения химеры или когда расчет среднеквадратичного отклонения невозможен, поскольку они не отслеживаются в HAdV-C5, отображаются фиолетовым цветом.Указывается ориентация относительно капсида (снаружи / внутри). n.a., не доступен. ( B ) Выравнивание последовательностей гексоновых HVR из HAdV-C5 и HAdV-F41. Здесь и в (D) серые полосы обозначают прослеживаемые области. Кислотная область HAdV-C5 выделена черным прямоугольником. Аминокислоты окрашены по полярности. ( C ) Наложение мономера основания пентона HAdV-C5 (идентификатор PDB: цепь M 6B1T, розовый) и HAdV-F41, окрашенного RMSD, как на (A). Вариабельные области перестройки связывания петель и волокон показаны на карте серой сеткой.( D ) Выравнивания последовательностей, фокусирующиеся на N-концевом плече основания пентона (PB), вариабельных и гипервариабельных петлях и гидрофобном крае; и на N-концевых пептидах HAdV-C5 (PDB ID: 3IZO) и l (длинное) и s (короткое) волокна HAdV-F41. Черные прямоугольники выделяют мотивы последовательности RGD / IGDD, консервативный пептид волокна и неконсервативный Ser 426 в гидрофобном ободе. Гистограмма показывает среднюю парную идентичность по всем парам в столбце. ( E ) Пентамер на основе пентона показан с одним мономером черным цветом, а остальными — белым.Гидрофобные остатки, консервативные с помощью HAdV-C5 в связывающем волокна кольце, окрашены в голубой цвет (Phe 412 , Tyr 413 , Tyr 419 и Leu 422 ), а неконсервативные (Ser 426 ) — в темно-бордовый . ( F ) Пентамеры на основе пентона HAdV-C5 и HAdV-F41, окрашенные поверхностным электростатическим потенциалом.

    Vertex capsomer: Penton base

    Архитектура базового белка пентона HAdV-F41 очень похожа на архитектуру HAdV-C5 (рис. 2C и таблица S2) ( 5 ).Как и в ранее решенных структурах ( 4 , 6 ), первые 34 аминокислоты не могли быть отслежены (рис. 2D и таблица S4). Эта область либо гибкая, либо скрыта в шумной, неикосаэдрической плотности ядра. Однако низкая плотность предполагает его расположение в HAdV-F41 (см. Раздел «Белки VI и VII и дополнительные внутренние элементы» ниже). Белок на 63 аминокислоты короче, чем в HAdV-C5 (таблица S2). Эта разница в длине в основном соответствует гипервариабельной петле на периферии пентамера, которая в HAdVC-5 несет мотив последовательности интегрин-связывающего RGD (Arg-Gly-Asp) (рис.2, В и Г). Все HAdV несут этот мотив RGD, за исключением HAdV-F40 и HAdV-F41, которые вместо этого содержат RGAD (Arg-Gly-Ala-Asp) и IGDD (Ile-Gly-Asp-Asp) ( 21 ) и HAdV-D60. , имеющий делецию петли ( 22 ). Цикл RGD очень гибкий, что исключает его отслеживание в любой из доступных структур. В HAdV-F41 участок, содержащий IGDD, на 57 остатков короче, чем петля RGD HAdV-C5, но также не может быть прослежен (рис. 2, C и D и таблица S4), что указывает на то, что, несмотря на то, что он намного короче, он является также гибкий.Вариабельная петля (от Glu 148 до Leu 156 ), одна из наименее консервативных областей в последовательностях пентоновых оснований и аналогичным образом экспонированная на периферии пентамера, также имеет другую конформацию в HAdV-F41 (рис. 2, C и D). Роль этой петли неизвестна, но было предложено создать сайт для генной терапии ( 23 ).

    N-концевые пептиды волокон AdV (рис. 2D) связываются с бороздкой, образованной на границе раздела между мономерами в пентамере основания пентона.И основание пентона, и остатки волокон, участвующие в этом взаимодействии, являются консервативными ( 23 ), и мы не наблюдаем структурных различий в этой области. Однако мы замечаем возможную разницу во взаимодействии между началом стержня волокна и кольцом гидрофобных остатков в центре пентамера ( 23 , 24 ). В этой области последовательности волокон не сохраняются (рис. 2D). В пентонном основании HAdV-F41 гидрофобные остатки, образующие кольцо, консервативны, за исключением HAdV-C5 Phe 489 , который вместо этого является полярным остатком (Ser 426 ) в HAdV-F41 (рис.2, Г и Д). Рядом с Ser 426 , Thr 427 до Thr 430 имеют большое RMSD от эквивалентных остатков в HAdV-C5 (фиг. 2C). Эта область образует часть более крупного участка (Tyr 419 — Leu 442 ), который претерпевает конформационную перестройку при связывании волокон ( 23 ). Эти наблюдения предполагают другой режим связывания волокна с пентоном в HAdV-F41, с менее гидрофобными и более водородными мостиковыми взаимодействиями, чем в HAdV-C5. Мы также находим некоторые различия между HAdV-C5 и HAdV-F41 во взаимодействиях между мономерами основания пентона и между основанием пентона и окружающими перипентональными гексонами, которые описаны в дополнительном тексте и на рис.S3 (B и C). Наконец, в полости пентамера, ориентированной к вирусному ядру, остатки Arg 47 в HAdV-C5 образуют положительно заряженное кольцо, отсутствующее в HAdV-F41, которое вместо этого имеет Gly 45 (рис. 2F). Это изменение заряда предполагает различное взаимодействие между основанием пентона и вирусным геномом или его упаковочным оборудованием.

    Внешняя цементирующая сеть: Protein IX

    Protein IX — единственный цементирующий белок, расположенный на внешней поверхности капсида мастаденовирусов.Предыдущие исследования ( 4 , 6 ) показали, что каждый из 12 мономеров протеина IX в фасете капсида AdV имеет расширенную конформацию и состоит из трех доменов. N-концевые домены трех молекул IX связаны в форме трискелиона. Один из четырех трискелионов в каждой грани занимает долину между гексонами на икосаэдрической оси тройной симметрии (I3), в то время как другие три лежат на локальных осях тройного порядка (L3), образованных гексонами 2, 3 и 4 в AU (рис. .1Б и 3А). Центральный домен белка IX очень гибкий и его также называют «веревочным доменом». В HAdV-C5 и HAdV-D26 веревочные домены трех конформационно уникальных молекул IX, каждая из которых происходит из разных трискелионов, обходят гексоны на поверхности грани икосаэдра, пока не достигают края. Там C-концевые домены этих трех молекул присоединяются к четвертому, выходящему из соседней грани, с образованием спиральной спирали с тремя параллельными и одной антипараллельной α-спиралями.На каждую грань приходится по три таких пучка из четырех спиралей (рис. 3А). У мастаденовирусов, отличных от человека, веревочный домен короче (рис. 3B), а С-концевые домены IX образуют спиральные спирали только с тремя параллельными α-спиралями, расположенными непосредственно поверх их N-концевых трискелионов (четыре таких пучка на фасетку). ), как показано на примере структуры AdV BAdV-3 крупного рогатого скота (фиг. 3A) ( 25 28 ). Из всех структурных белков HAdV-F41 белок IX наименее похож на его аналог HAdV-C5 (таблица S2).

    Рис. 3. Структура трискелиона белка IX.

    ( A ) Схема, показывающая организацию белка IX в HAdV-C5, BAdV-3 и HAdV-F41, где упорядочен только N-концевой домен. Трискелионы, расположенные на оси симметрии I3 (закрашенный треугольник), имеют голубой цвет, а расположенные на оси L3 (пустой треугольник) — несколько оттенков розового. Пунктирные линии: домены веревки в мономере HAdV-C5 One IX изображены голубым цветом в верхней части каждой схемы. ( B ) Выравнивание последовательности белка IX на основе структуры в HAdV-C5, HAdV-D26, HAdV-F41 и BAdV-3.Черный текст: остатки, смоделированные в различных структурах. Белый текст на черном фоне: регионы не смоделированы. Серый фон: смоделированные регионы, но не во всех независимых копиях IX. Красные прямоугольники: N-концевые дополнительные остатки в HAdV-F41, гидрофобное ядро ​​трискелиона и участок поли-Ala (отсутствует в BAdV-3). Синие прямоугольники выделяют два остатка Phe, обсуждаемые в тексте. Синие стрелки: два гибких изгиба. ( C ) N-концевой домен белка IX HAdV-F41 цвета радуги от синего (N-конец) до красного (последний отслеженный остаток), с картой плотности в серой сетке и увеличенным изображением гидрофобных остатков, обсуждаемых в тексте.( D ) Сравнение трискелионов в HAdV-C5 (PDB ID: 6B1T), HAdV-F41 и HAdV-D26 (PDB ID: 5TX1). Верхний ряд: трискелионы, если смотреть снаружи капсида. Внизу: вид, повернутый на 90 ° таким образом, чтобы поверхность гексоновой оболочки располагалась внизу.

    Мы проследили остатки от Val 10 до Gly 59 (фиг. 3C), которые образуют трискелион аналогично HAdV-C5. Как сообщалось ранее ( 4 ), трискелион поддерживается ядром гидрофобных остатков, Tyr 20 до Leu 21 в HAdV-F41 (рис.3, Б и Г). Первые остатки прослеживаются по центру трискелиона. Примечательно, что такая компоновка подразумевает, что Phe 12 и Phe 17 добавляют два уровня гидрофобных взаимодействий к ядру трискелиона (рис. 3D). В HAdV-C5 один из двух фенилаланинов отсутствует (Val 11 ; рис. 3B), а область, содержащая другой (Phe 6 ), не может быть прослежена, что означает отсутствие икосаэдрического порядка (рис. 3D). . Оба фенилаланиновых остатка (Phe 8 и Phe 13 ; рис.3B) моделируются в белке IX HAdV-D26, но в другой конформации, ориентированной наружу от ядра трискелиона (рис. 3D).

    Белок IX в HAdV-F41 имеет вставку из пяти остатков на N-конце по сравнению с HAdV-C5 (вставка из четырех остатков по сравнению с HAdV-D26). N-концевой домен еще короче у BAdV-3 (Fig. 3B). Мы предполагаем, что в HAdV-F41 область, содержащая два остатка фенилаланина, более упорядочена, чем в HAdV-C5, и имеет конформацию, отличную от HAdV-D26, из-за присутствия этих дополнительных остатков.Слабая плотность, покрывающая трискелион на оси I3, может объяснять наличие более длинного N-конца (рис. 4, A и B). Как плотная сеть гидрофобных остатков в ядре трискелиона, так и присутствие дополнительных остатков на N-конце IX будет усиливать межмолекулярные взаимодействия внутри трискелионов, вероятно, способствуя стабилизации тримеров белка IX. Ранее было показано, что трискелиона достаточно для обеспечения термостабильности капсида в HAdV-C5 ( 29 ).Более стабильные трискелионы могут повышать физико-химическую стабильность HAdV-F41.

    Рис. 4 Организация белка IX.

    ( A ) Плотность внешнего остатка (зеленый и желтый, без заточки, 0,2σ). Смоделированные трискелионы выделены голубым (ось I3, I3 NT) и пурпурным (оси L3, L3 NT). Пунктирные прямоугольники: расположение пучков спиралей в HAdV-C5. ( B ) Расшифровка остаточной карты. Помимо элементов, показанных на (A), плотность, выступающая на осях L3, отмечена синим цветом, а предлагаемый путь для доменов веревки, соответствующих каждому трискелиону, отмечен пунктирными линиями.( C ) Рисунок, представляющий гипотезу о том, что C-концевые домены связываются, образуя подвижную шиповидную структуру, плотность которой усредняется. Петли Hexon HVR2 будут ограничивать гибкость IX, создавая наиболее заметную размытую плотность (темно-синее пятно). Менее интенсивный темно-синий цвет представляет более слабую плотность, наблюдаемую в некоторых классах локализованной реконструкции (рис. S5B). ( D ) Веревочный домен молекул IX, образующих трискелион I3, следует разными путями в HAdV-C5 / D26 и HAdV-F41.Один из мономеров IX, образующих трискелион HAdV-D26 I3, выделен зеленым цветом; эквивалентный мономер в HAdV-F41 в голубом цвете; и трискелион HAdV-F41 L3 пурпурного цвета. Серая поверхность: карта остатков HAdV-F41. Гексоны (h4, h4 ′, h5) в полупрозрачной поверхности. Вверху: вид снаружи капсида, как показано на (A). Внизу: вид сбоку после поворота, как показано. Обратите внимание, что размытая плотность на L3 выступает над шестигранными башнями. ( E ) Увеличьте область, где заканчивается трискелион и поворачивается область веревки. Зеленые перекрывающиеся структуры IX в HAdV-C5 и HAdV-D26.Метки остатков HAdV-D26 подчеркнуты. Пунктирные линии: домены не отслеживаемых веревок в HAdV-C5 и HAdV-F41. Серая сетка: плотность остатков HAdV-F41, соответствующая области троса. Гексоновые аминокислоты со среднеквадратичным отклонением выше 2 Å выделены красным цветом.

    Неупорядоченная плотность для белка IX

    Неожиданно на карте HAdV-F41 отсутствует плотность, соответствующая С-концевому четырехспиральному пучку на краях икосаэдра. Вместо этого мы наблюдаем размытую плотность, выступающую радиально между башнями гексонов 2, 3 и 4, поверх трискелионов на оси L3 (рис.4B и рис. S4). Наличие этого выступа предполагает, что в HAdV-F41 С-концевые домены белка IX могут быть расположены аналогично более короткому белку IX в BAdV-3, образуя трехспиральный пучок, непосредственно примыкающий к каждому трискелиону (рис. . 3А). Однако на нашей карте HAdV-F41 нет эквивалентной слабой плотности около трискелиона на трехчленной икосаэдрической оси (рис. 4B и рис. S4), что указывает на то, что организация IX не такая, как в BAdV-3. Локальная реконструкция и классификация без обеспечения симметрии не дала никаких подмножеств частиц с выступом на оси I3 или с плотностью, которая могла бы указывать на наличие четырехспирального пучка на краях капсида (рис.S5). Следовательно, расположение C-концевого домена белка IX в HAdV-F41, по-видимому, не соответствует типичной архитектуре AdV человека или нечеловеческой структуры, наблюдаемой ранее.

    Карта остатков (демонстрирующая слабую плотность на поверхности капсида, не занятую прослеженными молекулами) указывает на связь между трискелионом на оси L3 и трискелионом в центре каждой грани (рис. 4, A и B). Мы интерпретируем, что эта связь соответствует веревочному домену одного из мономеров в центральном трискелионе, который, как и в HAdV-C5, проходит по поверхности капсида к периферии фасетки.Если это так, то возможно, что в HAdV-F41 C-концевые домены четырех копий белка IX (три из трискелиона L3 и одна из I3) взаимодействуют не по краям капсида, а по оси L3 (рис. . 4B). Почему же тогда на нашей карте нет разрешенного кластера спиралей? Прогнозы вторичной структуры показывают, что C-концевая спираль в HAdV-F41 короче, чем их аналоги в HAdV-C5, HAdV-D26 и BAdV-3 (рис. S6), поэтому одна из возможностей состоит в том, что пучок спиралей не сформирован или нестабильно.Однако в этом случае можно было бы ожидать аналогичных размытых (или отсутствующих) плотностей, генерируемых неупорядоченными C-концевыми доменами как на осях I3, так и на L3, что не так. Кроме того, для HAdV-F41 все еще прогнозируется образование спиральной спирали, даже если спирали короче (рис. S6, Lupas). Поэтому кажется вероятным, что существует некоторая ассоциация между C-концами молекул I3 и концами на L3. Другая возможность объяснить отсутствие четко определенной плотности состоит в том, что пучок из четырех спиралей формируется непосредственно поверх трискелиона L3, но поскольку домен гибкой веревки длиннее в HAdV-F41, чем в BAdV-3 (рис.3B), спиральная катушка не ограничивается взаимодействиями с гексонными башнями и образует подвижную шиповидную структуру, которая усредняется (рис. 4C). Это было бы похоже на усреднение дистальной части волокон, соединенных с основанием пентона гибким стержнем.

    Остается вопрос, почему пучок из четырех спиралей не образуется на краях фасеток, как в HAdV-C5 и HAdV-D26, если длина веревочного домена одинакова у всех трех вирусов (рис. 3B). Было высказано предположение, что белок IX в HAdV имеет два гибких изгиба, которые облегчают его связывание с контурами гексона (рис.3B) ( 28 ). В HAdV-C5 и HAdV-D26 первый гибкий изгиб вызывает поворот по часовой стрелке домена веревки на выходе из центрального трискелиона. В HAdV-F41 карта остатков указывает, что вместо этого поворот будет осуществляться против часовой стрелки (рис. 4D). Этот другой путь может определяться различиями во взаимодействиях гексона-IX около первого изгиба. Выравнивание последовательностей показывает, что веревочный домен в HAdV-F41 на три остатка короче, чем в HAdV-C5 и HAdV-D26, с делециями, расположенными точно на обоих изгибах (рис.3Б). Мы также наблюдаем, что гексон Tyr 784 , расположенный рядом с концом трискелиона (остатки с 56 по 59), является одним из немногих остатков с высоким RMSD при сравнении гексонных структур HAdV-F41 и HAdV-C5 (фиг. 2A и 4E). HAdV-C5 также содержит тирозин в этом положении, но последовательность выше у обоих вирусов сильно отличается, с заметным триплетом треонина в HAdV-F41 (остатки с 781 по 783). Все эти изменения могут привести к различным взаимодействиям, заставляющим белок IX изгибаться в другом направлении в кишечном вирусе.Как следствие, C-концевая спираль никогда не достигнет места, где образуется спиральная катушка в другом решенном HAdV.

    Белки IIIa и VIII

    Второстепенные белки оболочки IIIa и VIII выстилают внутреннюю поверхность капсида HAdV-F41. Пять копий белка IIIa расположены под каждой вершиной, соединяя пентон и перипентональные гексоны (Fig. 1B) и предположительно взаимодействуя с упаковывающими белками во время сборки ( 30 ). Степень прослеживаемого протеина IIIa и его архитектура очень похожи на HAdV-C5 (таблицы S2 и S4) с ранее описанной доменной организацией (рис.5, А и Б) ( 4 ). Белок IIIa HAdV-F41 имеет вставку из восьми аминокислот на N-конце с предсказанной α-спиральной структурой (остатки от 2 до 9; рис. 5C), которая может образовывать дополнительные внутримолекулярные взаимодействия в перипентональной области и вносить вклад в формирование вершинной области. более стабильный. Однако мы не наблюдали интерпретируемой плотности для этой вставки или для домена придатка (APD), прослеживаемого в HAdV-D26 (фиг. 5C) ( 6 ). Наибольшая разница с HAdV-C5 соответствует изгибу между четвертым и пятым витками спирали, соединяющей домен GOS-glue с доменом связывания VIII (рис.5, А и Б) ( 4 ). Этот перегиб может вызывать различия во взаимодействиях между соседними молекулами под вершиной (см. Следующий раздел).

    Рис. 5 Белки IIIa и VIII.

    ( A ) Наложение HAdV-C5 IIIa (PDB ID: 6B1T, цепь N) желтого цвета и HAdV-F41 IIIa, окрашенного RMSD, как на рис. 2. Клей GOS, соединяющая спираль, VIII-связывание и ядро указаны проксимальные домены. ( B ) Деталь соединительной спирали, чтобы показать ее соответствие крио-ЭМ карте.( C ) Схемы, показывающие выравнивание последовательностей белка IIIa в HAdV-C5, HAdV-D26 и HAdV-F41. Отслеживаемые домены показаны ниже разными цветами. APD — это домен-придаток, прослеживаемый в HAdV-D26, но не в двух других вирусах. Также указаны N-концевое удлинение в HAdV-F41 (N-term extra) и сайт расщепления созревания (ножницы). ( D ) Суперпозиция белка VIII HAdV-C5 (идентификатор PDB: 6B1T-цепь O) оранжевого цвета и HAdV-F41 VIII, окрашенного RMSD. Показаны области тела, шеи и головы, а также промежуток, соответствующий пептиду, отщепляемому во время созревания (ножницы).( E ) Выравнивание последовательностей, показывающее два центральных пептида протеина VIII, расщепленных AVP (AVPa и AVPb) в HAdV-C5, HAdV-D26 и HAdV-F41. Цветовые схемы аминокислот и гистограммы средней парной идентичности такие же, как на рис. 2.

    Две копии белка VIII присутствуют в каждой AU икосаэдрической оболочки AdV. Один из них взаимодействует с белком IIIa и способствует стабилизации вершины, а второй помогает удерживать неперипентональные гексоны вместе в центральной пластине фасетки (рис.1Б). Белок VIII HAdV-F41 является высококонсервативным по сравнению с HAdV-C5 как по последовательности, так и по структуре (фиг. 5D и таблица S2). Только центральная область белка, расщепленная протеазой созревания аденовируса (AVP) ( 31 ), демонстрирует расхождение последовательностей (фиг. 5E и см. Следующий раздел).

    Белки VI и VII и дополнительные внутренние элементы

    Анализ плотности, не занятой молекулами, прослеживаемыми до сих пор на крио-ЭМ карте HAdV-F41 [остаточная плотность (RD)], выявил несколько интересных особенностей (рис.6А). По краю центральной полости тримеров гексонов мы наблюдаем прерывистую слабую плотность (RD1), которая по сходству с HAdV-C5 соответствует пептидам pVIn и pVIIn 2 , отщепленным от белков-предшественников pVI и pVII во время созревания ( 5 , 8 ). Поскольку боковые цепи плохо определены в этих областях из-за отсутствия порядка и низкой занятости, мы только предварительно проследили четыре копии pVIn и две копии pVIIn 2 из 12 возможных эквивалентных сайтов в AU (рис.1B и 6B и таблица S4) ( 8 ). Белок VI длиннее в HAdV-F41, чем в HAdV-C5 (таблица S2), и несет конкретный эпитоп, общий для кишечных AdV (виды A и F) в своем центральном домене (остатки от 114 до 125) ( 32 ). Однако мы не наблюдаем какой-либо интерпретируемой плотности, которая могла бы сообщать либо о дополнительных взаимодействиях между более длинной цепью VI и гексоном, либо о центральной области, прослеживаемой в HAdV-C5 ( 5 ).

    Рис. 6 Дополнительные внутренние компоненты капсида HAdV-F41.

    ( A ) Слева: плотности остатков на одной грани (красный), не занятые прослеженными белками: гексон (голубой), пентон (светло-розовый), IIIa (желтый) или VIII (оранжевый). Справа: компоненты остаточной карты, обозначенные цветом от RD1 до RD4 (см. Текст). Плотности соответствуют нечеткой карте с контуром 1,5σ. ( B ) N-концевые пептиды белков VI (pVIn, две копии) и VII (pVIIn 2 ), предварительно прослеженные в RD1, внутри гексонной полости. ( C ) Предлагаемая интерпретация плотностей остатков RD3 и RD4.За исключением вставки с правой стороны, на карте с повышенной резкостью отображается RD с контуром 2,5σ. Оранжевая тонкая полоска: прорисованы части двух копий белка VIII (VIII вершина и VIII центральная пластинка). Оранжевые толстые черви: поли-Ala пептиды, смоделированные с неназначенными плотностями, которые, как предполагается, соответствуют центральному пептиду VIII. Левая вставка: возможно α-спиральная форма одной из плотностей остатков в RD3. Эта плотность намного слабее в RD4, где черная звезда указывает ее положение. Ножницы: сайт расщепления AVP в протеине VIII.Пептид pVIn представлен серой лентой, а возможное расположение его четырех не отслеживаемых N-концевых остатков обозначено черной пунктирной линией. На панели RD3 соединительная спираль IIIa выделена желтым цветом, первый остаток, отслеживаемый в базовом белке пентона (E 35), окрашен в розовый цвет, а пунктирная розовая линия указывает возможную траекторию не отслеживаемых 34 остатков. Масштабирование в правой рамке: соединительная спираль IIIa показана с перекрытием со спиралью HAdV-C5 красным цветом, а нерезкая карта с контуром 1σ показана серой сеткой, чтобы подчеркнуть плотность с низким разрешением, предлагаемую для соответствия N-концу пентона. рука.

    L-образные плотности на оси I3 и оси L3 между гексонами 2, 3 и 4 (RD2; рис. 6A) также наблюдались в HAdV-D26, но их отнесение не определено ( 6 ). В HAdV-F41 мы наблюдаем два дополнительных RD, о которых не сообщалось в предыдущих исследованиях ( 5 , 6 ). RD3 и RD4 расположены рядом с двумя независимыми копиями белка VIII и имеют сходные формы, но RD3 (расположенный под областью пентона) имеет более высокую плотность. И RD3, и RD4 находятся рядом с разрывом в протеине VIII, оставшимся в результате расщепления AVP во время созревания (рис.5, D и E и 6, A и C). В RD3 мы могли смоделировать два пептида поли-Ala. Один из них может соответствовать α-спирали из 21 остатка, а другой — удлиненному пептиду из 23 остатков (рис. 6C, вверху). Эти длины хорошо коррелируют с длинами пептидов pVIII, расщепляемых AVP (фиг. 5E). В HAdV-F41 один из этих пептидов на шесть остатков длиннее, чем в HAdV-C5 и HAdV-D26, и имеет низкую консервативность последовательности (фиг. 5E). В RD4 плотность меньше, и можно смоделировать только пептид с удлиненной длиной 10 остатков (рис.6С, внизу). Мы предполагаем, что по крайней мере часть RD3 и RD4 соответствуют этим вырезанным пептидам белка VIII, который в HAdV-F41 будет упорядочен и усиливает сеть контактов на внутренней поверхности капсида (особенно под вершиной), тем самым способствуя более высокая стабильность капсида. RD3 и RD4 также связаны с плотностью, соответствующей pVIn, и могут составлять его неотслеживаемые первые четыре остатка (фиг. 6C, черные пунктирные линии и таблица S4). Фрагментированная плотность в RD3, которая отсутствует в RD4, по-видимому, связана с первым отслеживаемым остатком в основании пентона, Glu 35 , и проходит параллельно соединительной спирали IIIa.Мы предполагаем, что эта плотность соответствует не отслеживаемому N-концу основания пентона (рис. 6C, розовая пунктирная линия), который будет взаимодействовать с изогнутой соединительной спиралью в IIIa, контакта, которого не было бы в HAdV-C5, где спираль не изогнутый (фиг. 5A), и последовательность N-концевой последовательности пентонного основания отличается (фиг. 2D).

    Определение идентичности слабых участков с прерывистой плотностью в AdV проблематично, поскольку существует множество компонентов вирионов, которые не соответствуют икосаэдрической симметрии (упаковочные белки, белок VI, половина белка IIIa, расщепленные пептиды и основные белки), что делает комбинаторная задача назначения последовательностей очень сложна и подвержена ошибкам ( 8 , 30 , 33 ).Тем не менее, наша интерпретация предполагает, что центральные пептиды pVIII, N-конец основания пентона и изогнутая спираль IIIa будут сотрудничать для усиления вершинной области HAdV-F41 способом, отличным от того, который ранее наблюдался в других HAdVs.

    ОБСУЖДЕНИЕ

    Узкий кишечный тропизм HAdV вида F изучен недостаточно. Анализы инфекционности показали, что, в отличие от HAdV-C5, эти вирусы не инактивируются кислой средой ( 14 ), и основным фактором, обеспечивающим устойчивость к низкому pH, по-видимому, является короткое волокно, одна из отличительных структурных особенностей HAdV- Ф ( 18 ).Здесь мы показываем, что капсиды HAdV-F41 более термостабильны, чем HAdV-C5, требуя более высоких температур, чтобы раскрыться и подвергнуть его геном действию растворителя, и что инфекционность стабильна, даже активируется в смоделированных желудочных и кишечных условиях. Мы определили структуру капсида HAdV-F41 с разрешением, близким к атомному, и проанализировали ее, ища возможные детерминанты ее тропизма и повышенной физико-химической стабильности.

    В то время как общие структуры гексона и пентонного основания консервативны, существуют различия в областях внешней петли, участвующих во взаимодействии с факторами хозяина, которые могут играть роль в энтеральном тропизме.Гексоновая петля HVR1 намного короче и жестка в HAdV-F41, чем в HAdV-C5. Отсутствие длинной кислотной области отражает отсутствие большого отрицательно заряженного участка в гексоновых башнях HAdV-F41 и может влиять на взаимодействие с факторами хозяина в условиях экстремального pH в желудочно-кишечном тракте. Однако кислотное растяжение также отсутствует в HAdV-D26, который имеет глазной тропизм и где HVR1 также полностью прослеживается ( 6 ). В основании пентона мотив RGD заменен на IGDD, и несущая его петля намного короче.Отсутствие последовательности RGD также не является детерминантом кишечного тропизма, поскольку этот мотив присутствует в других кишечных AdV, таких как HAdV-A31 (запись UniProtKB: D0Z5S7_ADE31) и HAdV-G52 (A0MK51_9ADEN). Несмотря на отсутствие мотива RGD, недавно было показано, что HAdV-F41 может связываться с ламинин-связывающими интегринами ( 34 ).

    AdV у видов F устойчивы к нейтрализации α-дефенсинами человека, малыми катионными антимикробными пептидами, обильно экспрессируемыми в тонком кишечнике, которые ингибируют инфекцию HAdV-C5 ( 35 ).Дефенсины связываются с поверхностью капсида, предотвращая отслоение, и связывание зависит от концентрации соли, что предполагает электростатическое взаимодействие ( 36 ). Тогда возникает соблазн считать, что устойчивость HAdV-F к дефензинам связана с отсутствием отрицательных зарядов на поверхности гексона. В поддержку этой гипотезы недавно было показано, что мутации, вносящие положительный заряд в HAdV-C5 гексон HVR1, придают устойчивость к нейтрализации дефенсина ( 37 ). Еще неизвестно, относится ли это также к другим респираторным AdV.AdVs у вида A также обладают кишечным тропизмом и не имеют кислого HVR1. Петля RGD также необходима для нейтрализации дефенсина ( 37 ). Вирусы в HAdV-A несут эту петлю, а вирусы в HAdV-F — нет, а дефенсины вызывают умеренное ингибирование HAdV-A12 ( 35 ). Мы предполагаем, что сочетание более короткой основной петли HVR1 в гексоне с отсутствием длинной петли RGD может играть роль в определении энтерального тропизма HAdV у видов F, помогая им сопротивляться нейтрализации энтеросолюбильными дефенсинами.

    Точную молекулярную основу стабильности вирусного капсида трудно разгадать, и она все еще является предметом интенсивных исследований даже для так называемых простых вирусов ( 38 ). Мы описываем некоторые межмолекулярные контакты, которые могут иметь различную природу в HAdV-F41 и HAdV-C5, но трудно сделать вывод, будут ли эти различия влиять на стабильность капсида из-за большой сложности и огромного количества взаимодействий, присутствующих в AdV. вирионы. Однако мы действительно находим частично упорядоченные особенности, которые предполагают сотрудничество между N-концом основания пентона, белком IIIa, pVIn и расщепленными пептидами VIII в стабилизации вершинной области.На внешней поверхности капсида трискелион белка IX имеет более сильное гидрофобное ядро, чем у HAdV-C5, в то время как остальная часть белка неупорядочена, в частности, отсутствует четырехспиральный пучок на его С-конце. Ранее было замечено, что пучок из четырех спиралей в HAdV-C5 легко нарушается, становясь беспорядочным, когда белок IX был модифицирован с помощью C-концевого слияния ( 39 ) или мечения антителом ( 40 ). Возможно, что отсутствие четко определенной плотности для С-концевой области IX на нашей карте HAdV-F41 просто вызвано частичным нарушением, случайно происходящим во время подготовки образца.Однако в исследованиях, где пучок спиралей HAdV-C5 не был четко виден, не наблюдалось слабой плотности в других местах капсида. Различия в последовательности и слабая плотность на карте подтверждают наличие организации для белка IX в HAdV-F41, отличной от всех, описанных для других AdV. Наши наблюдения также подразумевают, что формирование хорошо упорядоченного спирального пучка не требуется для повышения стабильности капсида, подтверждая идею о том, что трискелион является решающей частью цементирующего действия белка ( 29 ).Кроме того, наша модель предполагает, что кажущиеся незначительными изменения в домене веревочки могут быть ответственны за радикальное изменение организации белка IX в капсиде. Наконец, в нашей модели C-конец белка IX выступает из внешней поверхности капсида (рис. 4, C и D), что делает его интересным местом для вставки экзогенного пептида для перенацеливания, отображения эпитопа или других биотехнологических целей. как ранее предполагалось для белка IX в BAdV-3 ( 41 ). Вариации длины, последовательности и организации белка IX для разных типов AdV указывают на то, что этот белок подвергается эволюционному давлению, вызванному взаимодействием с хозяином, и подчеркивают его потенциальную роль в качестве детерминанты специфичности вируса к хозяину.

    МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

    Производство вируса

    Все эксперименты, описанные в этой работе, были выполнены с использованием EGFP-экспрессирующего, E1-удаленного вируса HAdV-F41-EGFP (предоставленного D. Brough, GenVec / Precigen), размноженного в 2V6. 11 клеток (Американская коллекция типовых культур, JHU67) с белком E4 orf6, индуцированным понастероном А (1 мкг / мл) за 24 часа до инфицирования. Клетки инфицировали при входной множественности инфицирования <0,1 флуоресцентных единиц (ФЕ) на клетку, и культуры инкубировали до полного или почти полного цитопатического эффекта (ЦПЭ), но до того, как клетки проявляли признаки распада.Колбы резко удаляли, чтобы удалить инфицированные клетки с поверхности, и клетки собирали центрифугированием при 1600 g в течение 10 мин, промывали PBS и затем ресуспендировали в небольшом объеме бессывороточной среды. Любые клетки, оставшиеся прикрепленными к колбе, повторно заполняли смесью свежей среды и осветленной среды в соотношении 1: 1 из инфицированных колб. Если неинфицированные клетки становились сливными, их затем субкультивировали, чтобы обеспечить распространение вируса. Процесс продолжался до завершения CPE, обычно через 1-2 недели после заражения.Потомство вируса высвобождали пятью циклами замораживания-оттаивания, и клеточный лизат осветляли центрифугированием при 1600 g в течение 10 минут. Вирусы использовали в экспериментах на уровне пассажа 3.

    Вирус очищали двумя циклами центрифугирования в градиенте плотности хлорида цезия (CsCl). На осветленный клеточный лизат (~ 4,5 мл) добавляли 4 мл CsCl [1,2 г / мл в 50 мМ трис-HCl (pH 8,1)] и 2 мл CsCl [1,4 г / мл в 50 мМ трис-HCl (pH 8,1). )]. Градиент центрифугировали в роторе SW41 при 120000 g при 4 ° C в течение 1 часа.Вирионы собирали с границы раздела каждого ступенчатого градиента и разбавляли в 50 мМ трис-HCl до плотности <1,2 г / мл, как определено путем измерения показателя преломления, и наслаивали поверх предварительно сформированного градиента (от 1,2 до 1,4 г / мл). который был подготовлен с использованием Gradient Master (BioComp). Градиент центрифугировали в роторе SW41 при 120000 g при 4 ° C в течение 2 часов. Вирусную полосу зрелых вирусных частиц выделяли и диализовали при 4 ° C против трех замен буфера для хранения [50 мМ трис-HCl (pH 8.1), 150 мМ NaCl, 10 мМ MgCl 2 и 10% глицерин] со сменой буфера каждые 45 мин. Оптическую плотность измеряли с помощью спектрофотометра NanoDrop ND-1000 (v3.3), а концентрацию вирионов рассчитывали по уравнению: 1A 260 = 1,1 × 10 12 частиц / мл ( 42 ). Инфекционность определяли с помощью анализов конечного разведения с клетками HEK293 в двух экземплярах в 60-луночных планшетах Terasaki, как описано ранее ( 43 ). Анализы оценивали на наличие зеленых клеток (экспрессирующих EGFP), и титры, рассчитанные по методу Рида и Мюнча ( 44 ), выражали в FU / мл.Очищенные частицы HAdV-F41 из двух разных препаратов объединяли и концентрировали центрифугированием в градиенте CsCl и хранили в 20 мМ Hepes (pH 7,8), 150 мМ NaCl и 10% глицерине при -80 ° C.

    HAdV-C5, используемый в качестве контроля для экспериментов с внешней флуоресценцией, представлял собой E1-E3-делетированный, GFP-экспрессирующий вектор Ad5 / attP, который является структурно диким типом ( 45 ), размножается при 37 ° C в клетках HEK293, собранных через 36 часов после заражения и очищали, как описано ( 8 ).

    Анализы на инфекционность в смоделированных желудочно-кишечных условиях

    Клетки HEK293 высевали в шестилуночные планшеты с плотностью 5 × 10 5 клеток на лунку за 1 день до инфицирования. Препараты HAdV-41-EGFP (~ 2 × 10 11 частиц / мл, 5 × 10 6 FU / мл) диализовали против бессывороточной среды и замораживали на короткое время. Затем вирус (50 мкл) смешивали в соотношении 1: 1 с 2-кратным синтетическим желудочным соком в соответствии с Фармакопеей США в 0,01 н. HCl [4,0 г NaCl и 6.4 г пепсина (Sigma-Aldrich), растворенного в 14 мл 1 н. HCl, доведенного до 1 литра с помощью ddH 2 O (pH 1,2)] и / или 2 × синтетической кишечной жидкости [13,6 г одноосновного фосфата калия в 250 мл ddH 2 O, 77 мл 0,4 N NaOH, 500 мл ddH 2 O, а затем 20,0 г панкреатина (Sigma-Aldrich), pH доведен до 6,8 и затем разбавлен водой до 1 литра] . Суспензию вируса инкубировали 1 час при 37 ° C. Для последовательного лечения вирус обрабатывали синтетической желудочной жидкостью в течение 1 часа при 37 ° C, затем смешивали 1: 1 с синтетической кишечной жидкостью и инкубировали в течение дополнительного часа.Для нейтрализации pH и протеаз полную минимальную необходимую среду, содержащую 10% фетальной бычьей сыворотки, добавляли до конечного объема 0,3 мл. Клетки HEK293 инфицировали обработанным или ложно обработанным вирусом в течение 1 часа при 37 ° C. Инокулят удаляли, клетки собирали через 19-21 час после заражения и фиксировали 2% параформальдегидом для проточной цитометрии. Экспрессию GFP анализировали с помощью LSR Fortessa (BD Biosciences), а данные анализировали с помощью FACSDiva (BD Biosciences), выделяя дублеты. Подсчитывали в общей сложности 10 000 клеток на лунку.Каждый эксперимент проводился в двух экземплярах.

    Анализы термостабильности внешней флуоресценции

    Данные для HAdV-C5 были опубликованы ранее ( 8 ). Данные для HAdV-F41 были собраны в тот же период времени в рамках большого исследования по сравнению термостабильности различных образцов AdV. Образцы HAdV-C5 и HAdV-F41 (5 × 10 9 частиц / мл в конечном объеме 800 мкл буфера) инкубировали в течение ночи при 4 ° C в 8 мМ Na 2 HPO 4 , 2 мМ KH 2 PO 4 , 150 мМ NaCl и 0.1 мМ ЭДТА (pH 7,4). Спектры флуоресценции образцов вируса, смешанных с YOYO-1, получали каждые 2 ° C в диапазоне температур от 20 до 70 ° C на спектрофотометре Horiba FluoroLog. Краситель возбуждали на длине волны 490 нм, максимальная интенсивность излучения достигалась при длине волны 509 нм. Необработанные спектры корректировали путем вычитания спектра YOYO-1 в буфере при каждой тестируемой температуре. Всего было рассмотрено шесть (HAdV-C5) и четыре (HAdV-F41) независимых экспериментов для каждой усредненной кривой. Температуры полуперехода ( T 0.5 ) были рассчитаны путем подгонки кривой усредненной интенсивности флуоресценции как функции температуры к уравнению сигмоидной формы Больцмана, как описано ( 8 ).

    Подготовка проб Cryo-EM и сбор данных

    Объединенные и концентрированные образцы HAdV-F41 (как описано выше) диализовали против 50 мМ трис-HCl (pH 7,8), 150 мМ NaCl и 10 мМ MgCl 2 для 1 час при 4 ° C и затем концентрировали вращением в устройстве Microcon YM-100 в течение 15 минут при 4 ° C, до конечной расчетной концентрации 3.1 × 10 12 вирусных частиц / мл. Образцы осаждали в решетках Quantifoil R2 / 4 300 меш Cu / Rh с тлеющим разрядом и застекловывали в жидком этане после ручного блоттинга в устройстве Leica CPC. Крио-ЭМ-изображения (таблица S1) были записаны в Центре Центральноевропейского технологического института (CEITEC) (Брно, Чешская Республика) с использованием микроскопа Titan Krios на 300 кВ, оснащенного детектором Falcon II, с общей дозой 42 электронов. — / Å 2 распределено по 25 кадрам с номинальным размером пикселя 1.38 Å и диапазон расфокусировки от -1 до -2,5 мкм.

    Анализ данных Cryo-EM

    Все задачи обработки изображений и трехмерной (3D) реконструкции выполнялись в рамках Scipion ( 46 ). Кадры со 2 по 24 каждого фильма были выровнены с использованием коррекции движения всего изображения, реализованной в Xmipp, с последующей коррекцией локальных движений с помощью Optical Flow ( 47 ). Передаточная функция контраста (CTF) оценивалась с использованием CTFFIND4 ( 48 ). Частицы были полуавтоматически выбраны из микрофотографий, скорректированных на фазовые колебания CTF (перевернутая фаза), извлечены в блоки размером 780 × 780 пикселей, нормализованы и подвергнуты субдискретизации с коэффициентом 2 с использованием Xmipp ( 49 ).Все 2D и 3D классификации и уточнения были выполнены с использованием RELION ( 50 ). 2D-классификация использовалась для отбрасывания частиц низкого качества и выполнения 25 итераций с 50 классами, угловой выборкой 5 ° и параметром регуляризации T = 2. Классификация в 3D выполнялась для 40 итераций с тремя классами, начиная с угловая выборка 3,7 ° и последовательное уменьшение до 0,5 °, а параметр регуляризации T = 4. Икосаэдрическая симметрия накладывалась на протяжении всего процесса уточнения.Первоначальным эталоном для 3D-классификации была крио-ЭМ карта AdV ( 51 ), прошедшая низкочастотную фильтрацию с разрешением 60 Å. Класс, дающий наилучшее разрешение, был индивидуально уточнен с использованием исходных частиц размером 780 пикселей в рамке и карты, полученной во время 3D-классификации, в качестве эталона, создавая окончательную карту с разрешением 4,0 Å, согласно оценке в соответствии с золотым стандартом корреляции Фурье-оболочки. (FSC) = 0,143 критерий, реализованный в подпрограммах автоопределения и постобработки RELION ( 52 ).Локальное разрешение оценивалось с помощью ResMap ( 53 ). Глобальный B-фактор оценивался после деления преобразования Фурье карты на передаточную функцию модуляции детектора Falcon II. Фактическая выборка для карты была оценена путем сравнения с моделью HAdV-C5 [Protein Data Bank (PDB) ID: 6B1T] ( 5 ) в UCSF Chimera ( 54 ), что дало значение 1,36 Å / пикс.

    Локальная реконструкция и классификация выбранных областей интереса были выполнены в соответствии с общей методологией, описанной в ( 55 ), с использованием RELION, реализованного в Scipion ( 56 ).Процедура состоит из следующих шагов. (i) Маска, исключающая интересующую область, была применена к трехмерной карте, полученной в результате уточнения с принудительной икосаэдрической симметрией. (ii) Маскированная карта проецировалась в направлениях, определенных уточнением икосаэдра, и проекции вычитались из соответствующих экспериментальных изображений. (iii) Положение интересующего объекта на трехмерной карте было определено и спроецировано в направлении проекции, присвоенном каждому экспериментальному изображению, и его 59 направлениям, связанным с симметрией.В результате был получен набор из 595 560 координат (60 × 9926; таблица S1). (iv) Набор координат был сокращен, так что координаты ближе 180 пикселей к проекции вирусного центра были отброшены, чтобы минимизировать помехи от остаточного сигнала капсида и ядра. (v) Используя полученные координаты, приблизительно 490 000 субчастиц были извлечены из исходных экспериментальных изображений в квадратах размером 100 × 100 пикселей. (vi) Направление проекции, назначенное каждой субчастице, было тем, которое использовалось для создания соответствующей ей координаты.(vii) Затем эти изображения были подвергнуты трехмерной классификации на четыре класса без изменения ориентации или обеспечения симметрии (симметрия C1).

    После завершения процесса классификации разрешение каждого класса оценивалось с использованием двух подходов. В первом набор изображений был разделен на две случайные группы и использовался критерий FSC с пороговым значением 0,143. Во втором подходе локальное разрешение вычислялось с помощью ResMap ( 53 ). Результаты первого подхода казались нереально высокими (рис.S5), поскольку они были близки к Найквисту, не подтверждались аспектом карты, а кривая FSC не показывала резкого падения. Это наблюдение указывает на то, что случайное разделение субчастиц после классификации не сохраняет независимые подмножества, используемые при уточнении икосаэдра и требуемые для значимых вычислений FSC. С другой стороны, ResMap, который локально сравнивает сигнал и шум, кажется, дает более реалистичную оценку.

    Построение и анализ модели

    Интерпретация 3D-карты HAdV-F41 была выполнена с использованием рабочего процесса молекулярного моделирования на основе гомологии последовательностей в Scipion ( 57 ).Чтобы упростить отслеживание цепочки, мы использовали MonoRes ( 58 ) и Localdeblur ( 59 ), чтобы повысить резкость карты в соответствии с местным разрешением. Исходную модель для каждой полипептидной цепи предсказывали с помощью Modeller ( 60 ), используя в качестве входной матрицы структуру соответствующей цепи гомолога HAdV-C5 (PDB ID: 6B1T). UCSF Chimera ( 54 ) использовался для выполнения жесткой подгонки исходной модели каждой цепочки к усиленной карте. Затем подобранная модель каждой цепи была уточнена с использованием Coot ( 61 ) и Phenix для уточнения в реальном пространстве ( 62 ).Метрики валидации для оценки качества атомной структуры были рассчитаны с помощью алгоритма комплексной валидации Phenix (крио-ЭМ). После того, как мы сгенерировали всю структуру AU, была выполнена программа Chimera findclash (интегрированная в протокол chimera-contacts Scipion) для определения возможных контактов между парами цепочек, содержащихся в AU, или между цепочкой в ​​AU и цепочкой из соседнего AU. (файл S1). Параметры по умолчанию, обрезание (-0,4) и допуск (0,0), использовались для сообщения в качестве возможных связей всех пар атомов, расстояние которых не превышает сумму соответствующих ван-дер-ваальсовых радиусов плюс 0.4 Å. Чтобы идентифицировать дополнительные немоделированные плотности, мы сгенерировали карты остатков с помощью Chimera двумя альтернативными способами: (i) вычитая из крио-EM-карты карту, созданную с помощью molmap вокруг моделируемых атомов (разрешение 2,0 и gridSpacing 1,36) или (ii) маскирование. от исходной карты область в радиусе 3, 4 или 8 Å от моделируемых атомов (vol zone invert true).

    Заряд белка при pH 7,0 был рассчитан, как описано в http://isoelectric.org/index.html, с аминокислотой p K a (где K a — константа кислотной диссоциации) взятые значения из ( 63 ) и общие значения p K a значения для концевых амино и карбоксильных групп, взятые из ( 64 ).Выравнивание последовательностей белков выполняли с помощью Clustal W2 (www.clustal.org/clustal2/), интегрированного в Geneious версии 2019.0 (www.geneious.com). Для предсказания вторичной структуры мы использовали Jpred4 Server Jnet версии 2.3.1 (www.compbio.dundee.ac.uk/jpred) ( 65 ) или PSIPRED ( 66 ). Молекулярная графика и анализ, включая суперпозицию молекул, вычисление среднеквадратичного отклонения, визуализацию карты, нормализацию карты, окраску и измерение поверхностных пятен и визуализацию электростатического потенциала поверхности, были выполнены с помощью UCSF Chimera и ChimeraX ( 54 , 67 ).Пыль UCSF Chimera Hide использовалась для наглядности при составлении фигур, представляющих карты плотности.

    Благодарности: Мы благодарим Й. Новачека и М. Петерека на предприятии CEITEC (Брно, Чешская Республика) за сбор крио-ЭМ данных. Первоначальный посевной материал для HAdV-F41-EGFP был подарком Д. Броу (GenVec / Precigen). Мы благодарим M. J. van Raaij (CNB-CSIC) за внимательное чтение и содержательные комментарии к рукописи; М. Менендес (IQFR-CSIC), М. Кастелланос и Л. А. Кампос (CNB-CSIC) за советы по измерениям и анализу флуоресценции; М.И. Лагуна (CNB-CSIC) за квалифицированную техническую помощь; М. Чагойен (CNB-CSIC) за советы по инструментам биоинформатики; и Дж. М. Карасо (CNB-CSIC) за постоянную поддержку. Финансирование: Эта работа была поддержана грантами PID2019-104098GB-I00 / AEI / 10.13039 / 501100011033 и BFU2016-74868-P, совместно финансируемыми Испанским государственным агентством исследований и Европейским фондом регионального развития; BFU2013-41249-P и BIO2015-68990-REDT (испанская сеть аденовирусов, AdenoNet) от Министерства экономики, промышленности и конкурентоспособности Испании; и Agencia Estatal CSIC (2019AEP045) до C.С.М. CNB-CSIC дополнительно поддерживается грантом Severo Ochoa Excellence (SEV 2017-0712). Работа в M.B’s. лаборатория была поддержана грантом 194562-08 Совета естественных наук и инженерных исследований Канады. М.Х.-П. является получателем постдокторского контракта Хуана де ла Сьервы, финансируемого Государственным исследовательским агентством Испании. М.П.-И. имеет пред-докторский контракт от La Caixa Foundation (ID 100010434) по соглашению LCF / BQ / SO16 / 52270032. Доступ к CEITEC был поддержан проектом iNEXT, номер 653706, финансируемым программой Horizon 2020 Европейского Союза.Основное оборудование для криоэлектронной микроскопии и томографии CEITEC поддерживается программой MEYS CR (LM2018127). Вклад авторов: M.B., R.M., and C.S.M. разработал исследование. M.P.-I., M.M., G.N.C., M.H.-P., C.M., MB, R.M. и C.S.M. провел исследование. M.P.-I., M.M., M.H.-P., C.M., MB, R.M. и C.S.M. проанализированные данные. М.М. и Р. предоставил инструменты анализа. М.П.-И. и C.S.M. написал статью при участии всех других авторов. Конкурирующие интересы: Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов. Доступность данных и материалов: КриоЭМ карта и модель HAdV-F41 хранятся в банке данных электронной микроскопии (EMDB; www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb) и PDB (www.ebi.ac.uk) / pdbe /) с инвентарными номерами EMD-10768 и 6YBA соответственно. Отчет о проверке включен как файл данных S2.

    Совместная служба обновлений для OLYMPUS E-SYSTEM

    Обновление прошивки корпуса камеры можно выполнить, используя только корпус камеры.
    Для обновления прошивки объектива требуются и корпус камеры, и объектив.
    Процедура обновления зависит от комбинации корпуса камеры и объектива. В следующей таблице описана процедура обновления в каждой комбинации.




    Э-СИСТЕМА OLYMPUS


    Обновление прошивки для серии OM-D

    Название модели

    вер.

    Описание

    E-M1X 2,2 Нажмите здесь 19 июля 2021 г.
    E-M1 Mark III 1,4 Нажмите здесь 19 июля 2021 г.
    E-M1 Mark II 3.5 Нажмите здесь 09 июня 2021 г.
    E-M1 4,6 Нажмите здесь 14 февраля 2019 г.
    E-M5 Mark III 1,5 Нажмите здесь 09 июня 2021 г.
    E-M5 Mark II 4.1 Нажмите здесь 24 января 2019 г.
    E-M5 2,3 Нажмите здесь 18 декабря 2018 г.
    E-M10 Mark III 1,2 Нажмите здесь мар.07, 2019
    E-M10 Mark II 1,4 Нажмите здесь 07 марта 2019 г.
    E-M10 1,4 Нажмите здесь 18 декабря 2018 г.

    Обновление прошивки для серии Pen

    Название модели

    вер.

    Описание

    PEN-F 3,1 Нажмите здесь 24 января 2019 г.
    E-P5 1,8 Нажмите здесь дек.18, 2018
    E-P3 1,6 Нажмите здесь 18 декабря 2018 г.
    E-P2 1,3 Нажмите здесь 12 июня 2013 г.
    E-P1 1.4 Нажмите здесь 22 апреля 2010 г.
    E-PL9 1,1 Нажмите здесь 26 апреля 2018 г.
    E-PL8 1,1 Нажмите здесь мая.10, 2018
    E-PL7 1,4 Нажмите здесь мая. 10, 2018
    E-PL6 1,4 Нажмите здесь 18 декабря 2018 г.
    E-PL5 1.6 Нажмите здесь 18 декабря 2018 г.
    E-PL3 1,6 Нажмите здесь 18 декабря 2018 г.
    E-PL2 1,4 Нажмите здесь июн.12, 2013
    E-PL1 1,3 Нажмите здесь 12 июня 2013 г.
    E-PM2 1,6 Нажмите здесь 18 декабря 2018 г.
    E-PM1 1.6 Нажмите здесь 18 декабря 2018 г.

    Обновление микропрограммы для объективов M.ZUIKO DIGITAL

    Название модели

    вер.

    Описание

    М.ZUIKO DIGITAL ED 7-14 мм F2.8 PRO 1,1 Нажмите здесь 26 ноября 2015 г.
    M.ZUIKO DIGITAL ED 9-18 мм F4.0-5.6 1,2 Нажмите здесь 9 февраля 2016 г.
    M.ZUIKO DIGITAL ED 12-40 мм F2.8 PRO 1.3 Нажмите здесь 10 ноября 2016 г.
    M.ZUIKO DIGITAL ED 12-50 мм F3,5-6,3 EZ 1,4 Нажмите здесь 01 ноября 2016 г.
    M.ZUIKO DIGITAL ED 12-100 мм F4.0 IS PRO 1,4 Нажмите здесь авг.04, 2020
    M.ZUIKO DIGITAL ED 14-42 мм F3,5-5,6 EZ 1,2 Нажмите здесь 10 ноября 2016 г.
    M.ZUIKO DIGITAL ED 14-42 мм F3,5-5,6 * a 1,1 Нажмите здесь сен.15, 2009
    M.ZUIKO DIGITAL 14-42 мм F3,5-5,6 II 1,1 Нажмите здесь 21 июля 2011 г.
    M.ZUIKO DIGITAL ED 14-150 мм F4.0-5.6 1,1 Нажмите здесь 21 июля 2011 г.
    М.ZUIKO DIGITAL ED 40-150 мм F2.8 PRO 1,3 Нажмите здесь 19 июня 2019 г.
    M.ZUIKO DIGITAL ED 8 мм F1.8 Fisheye PRO 1,2 Нажмите здесь 24 января 2019 г.
    M.ZUIKO DIGITAL ED 12 мм F2.0 1,1 Нажмите здесь 26 ноября 2015 г.
    M.ZUIKO DIGITAL 17 мм F1,8 1,1 Нажмите здесь 26 ноября 2015 г.
    M.ZUIKO DIGITAL 17 мм F2.8 1,1 Нажмите здесь сен.15, 2009
    M.ZUIKO DIGITAL ED 25 мм F1.2 PRO 1,1 Нажмите здесь 24 января 2019 г.
    M.ZUIKO DIGITAL 25 мм F1,8 1,1 Нажмите здесь 26 ноября 2015 г.
    М.ZUIKO DIGITAL ED 45 мм F1.2 PRO 1,1 Нажмите здесь 24 января 2019 г.
    M.ZUIKO DIGITAL 45 мм F1,8 1,2 Нажмите здесь 26 ноября 2015 г.
    M.ZUIKO DIGITAL ED 60 мм F2.8 Macro 1.2 Нажмите здесь 26 ноября 2015 г.
    M.ZUIKO DIGITAL ED 75 мм F1,8 1,2 Нажмите здесь 26 ноября 2015 г.
    M.ZUIKO DIGITAL ED 300 мм F4.0 IS PRO 1,5 Нажмите здесь июн.19, 2019
    * Прошивка для M.ZUIKO DIGITAL ED 14-42mm F3.5-5.6 L отличается от прошивки для M.ZUIKO DIGITAL ED 14-42mm F3.5-5.6.
    Последней версией для M.ZUIKO DIGITAL ED 14-42mm F3.5-5.6 L является версия 1.0. Обновление прошивки не требуется.
    Обновление прошивки для серии Four Thirds

    Название модели

    вер.

    Описание

    E-5 1,3 Нажмите здесь 21 марта 2012 г.
    E-3 1,4 Нажмите здесь апр.09, 2009
    E-1 * b 1,5 Нажмите здесь 20 ноября 2007 г.
    E-30 1,1 Нажмите здесь 2 апреля 2009 г.
    E-520 1.1 Нажмите здесь 30 сентября 2008 г.
    E-510 1,3 Нажмите здесь 29 января 2008 г.
    E-500 1,3 Нажмите здесь нояб.20 августа 2007 г.
    E-420 1,1 Нажмите здесь 30 сентября 2008 г.
    E-410 1,3 Нажмите здесь 20 ноября 2007 г.
    E-330 1.3 Нажмите здесь 20 ноября 2007 г.
    E-300 1,5 Нажмите здесь 20 ноября 2007 г.
    * б [Обновление прошивки для E-1]
    Для обновления прошивки E-1 используйте OLYMPUS Studio 2, OLYMPUS Studio 1 или OLYMPUS Viewer.

    Обновление прошивки для объективов ZUIKO DIGITAL

    Название модели

    вер.

    Описание

    ZUIKO DIGITAL ED 8mm F3.5 Fisheye 1,1 Нажмите здесь мая.19 августа 2009 г.
    ZUIKO DIGITAL ED 9-18 мм F4.0-5.6 1,1 Нажмите здесь 11 марта 2009 г.
    ZUIKO DIGITAL ED 12-60 мм F2,8-4,0 SWD 1,2 Нажмите здесь сен.21 августа 2010 г.
    ZUIKO DIGITAL 14-54 мм F2,8-3,5 1,1 Нажмите здесь 28 января 2004 г.
    ZUIKO DIGITAL ED 50-200 мм F2,8-3,5 1,1
    ZUIKO DIGITAL 14-54 мм F2,8-3,5 II 1.1 Нажмите здесь 5 февраля 2009 г.
    ZUIKO DIGITAL ED 18-180 мм F3,5-6,3 1,2 Нажмите здесь мая. 19 августа 2009 г.
    ZUIKO DIGITAL 25 мм F2.8 1,2 Нажмите здесь окт.29 августа 2008 г.
    ZUIKO DIGITAL 35 мм F3.5 Макро 1,2 Нажмите здесь 29 октября 2008 г.
    ZUIKO DIGITAL ED 14-35 мм F2.0 SWD 1,1 Нажмите здесь 21 сентября 2010 г.
    ZUIKO DIGITAL ED 14-42 мм F3.5-5,6 1,3 Нажмите здесь 29 октября 2008 г.
    ZUIKO DIGITAL ED 35-100 мм F2.0 1,2 Нажмите здесь 29 октября 2008 г.
    ZUIKO DIGITAL ЭД 40-150мм F4.0-5,6 1,3 Нажмите здесь 29 октября 2008 г.
    ZUIKO DIGITAL ED 50-200 мм F2.8-3.5 SWD 1,1 Нажмите здесь 21 сентября 2010 г.
    ZUIKO DIGITAL ED 50-200 мм F2,8-3,5 1.1 Нажмите здесь 28 января 2004 г.
    ZUIKO DIGITAL ED 70-300 мм F4,0-5,6 1,4 Нажмите здесь 16 февраля 2012 г.
    ZUIKO DIGITAL ED 90-250 мм F2.8 1.2 Нажмите здесь Май. 19 августа 2009 г.
    ZUIKO DIGITAL 40-150 мм F3,5-4,5 1,1 Нажмите здесь 15 декабря 2004 г.
    Расширение Трубка EX-25 1.1
    Телеконвертер EC-14 1,1
    Телеконвертер EC-20 1,1 Нажмите здесь 19 декабря 2007 г.

    Совместная служба обновления объективов Four Thirds


    Обновление прошивки объективов Panasonic (Micro Four Thirds)

    Название модели

    вер.

    Описание

    Выпуск

    LUMIX G VARIO 7-14 мм / F4.0 (H-F007014) 1,1 Нажмите здесь 25 ноября 2009 г.
    LUMIX G VARIO 12-32 мм / F3,5-5,6, АСФЕРИЧЕСКИЙ / MEGA O.I.S.
    (H-FS12032)
    1.2 Нажмите здесь 21 июля 2020 г.
    LUMIX G X VARIO 12-35 мм / F2,8 II, АСФ. / POWER O.I.S. (H-HSA12035) 1,1 Нажмите здесь 08 июня 2021 г.
    LUMIX G X VARIO 12-35 мм / F2,8, АСФЕРИЧЕСКИЙ / POWER O.I.S.
    (H-HS12035)
    1.3 Нажмите здесь 18 августа 2015 г.
    LUMIX G VARIO 12-60 мм / F3,5-5,6, АСФЕРИЧЕСКИЙ / POWER O.I.S. (H-FS12060) 1,3 Нажмите здесь 08 июня 2021 г.
    LUMIX G X VARIO PZ 14-42 мм / F3,5-5,6, АСФЕРИЧЕСКИЙ./ POWER O.I.S. (H-PS14042) 1,2 Нажмите здесь 28 марта 2013 г.
    LUMIX G VARIO 14-42 мм / F3,5-5,6 II, АСФЕРИЧЕСКИЙ / MEGA O.I.S. (H-FS1442A) 1,1 Нажмите здесь 18 августа 2015 г.
    LUMIX G VARIO 14-42 мм / F3.5-5,6 АСФ. / MEGA O.I.S.
    (H-FS014042)
    1,1 Нажмите здесь 13 сентября 2011 г.
    LUMIX G VARIO 14-45 мм / F3,5-5,6, АСФЕРИЧЕСКИЙ / MEGA O.I.S.
    (H-FS014045)
    1,2 Нажмите здесь ноя.25 августа 2009 г.
    LUMIX G VARIO 14–140 мм / F3,5–5,6, АСФЕРИЧЕСКИЙ / POWER O.I.S. (H-FS14140) 1,2 Нажмите здесь 6 октября 2016 г.
    LUMIX G VARIO HD 14-140 мм / F4,0-5,8, АСФЕРИЧЕСКИЙ / MEGA O.I.S. (H-VS014140) 1,4 Нажмите здесь дек.7, 2010
    LUMIX G X VARIO 35-100 мм / F2,8 II / POWER O.I.S. (H-HSA35100) 1,1 Нажмите здесь 08 июня 2021 г.
    LUMIX G X VARIO 35-100 мм / F2,8 / POWER O.I.S.
    (H-HS35100)
    1,3 Нажмите здесь авг.18, 2015
    LUMIX G VARIO 35-100 мм / F4,0-5,6, АСФЕРИЧЕСКИЙ / MEGA O.I.S.
    (H-FS35100)
    1,3 Нажмите здесь 21 июля 2020 г.
    LUMIX G VARIO 45-150 мм / F4,0-5,6, АСФЕРИЧЕСКИЙ / MEGA O.I.S.
    (H-FS45150)
    1,2 Нажмите здесь дек.08, 2015
    LUMIX G X VARIO PZ 45-175 мм / F4,0-5,6, АСФЕРИЧЕСКИЙ / POWER O.I.S. (H-PS45175) 1,3 Нажмите здесь 24 апреля 2017 г.
    LUMIX G VARIO 45-200 мм / F4,0-5,6 II / POWER O.I.S. (H-FSA45200) 1,1 Нажмите здесь июн.08, 2021
    LUMIX G VARIO 45-200 мм / F4,0-5,6 / MEGA O.I.S.
    (H-FS045200)
    1,3 Нажмите здесь 29 февраля 2012 г.
    LUMIX G VARIO 100-300 мм / F4,0-5,6 II / POWER O.I.S. (H-FSA100300) 1,1 Нажмите здесь июн.08, 2021
    LUMIX G VARIO 100-300 мм / F4,0-5,6 / MEGA O.I.S.
    (H-FS100300)
    1,2 Нажмите здесь 25 января 2012 г.
    LUMIX G FISHEYE 8 мм / F3,5 (H-F008) 1,1 Нажмите здесь сен.13 августа 2011 г.
    LUMIX G 14 мм / F2,5, АСФЕРИЧЕСКИЙ. (H-H014) 1,1 Нажмите здесь 13 сентября 2011 г.
    LUMIX G 20 мм / F1,7 (H-H020) 1,1 Нажмите здесь 25 ноября 2009 г.
    LUMIX G 25 мм / F1.7 АСИФ. (H-H025) 1,1 Нажмите здесь мая. 10, 2018
    LUMIX G MACRO 30 мм / F2,8, АСФЕРИЧЕСКИЙ / MEGA O.I.S. (H-HS030) 1,3 Нажмите здесь мая. 10, 2018
    LUMIX G 42.5 мм / F1,7, АСФЕРИЧЕСКИЙ / МОЩНОСТЬ O.I.S. (H-HS043) 1,2 Нажмите здесь мая. 10, 2018
    LEICA DG VARIO-ELMARIT 8-18 мм / F2,8-4,0, АСФЕРИЧЕСКИЙ. (H-E08018) 1,1 Нажмите здесь 08 июня 2021 г.
    LEICA DG VARIO-SUMMILUX 10-25 мм / F1.7 АСИФ. (H-X1025) 1,1 Нажмите здесь 08 июня 2021 г.
    LEICA DG VARIO-ELMARIT 12-60 мм / F2,8-4,0, АСФЕРИЧЕСКИЙ / POWER O.I.S. (H-ES12060) 1,2 Нажмите здесь 08 июня 2021 г.
    LEICA DG VARIO-ELMARIT 50-200 мм / F2.8-4,0 АСФ. / МОЩНОСТЬ. (H-ES50200) 1,1 Нажмите здесь 08 июня 2021 г.
    LEICA DG VARIO-ELMAR 100-400 мм / F4,0-F6,3, АСФЕРИЧЕСКИЙ / POWER O.I.S. (H-RS100400) 1,3 Нажмите здесь 08 июня 2021 г.
    LEICA DG SUMMILUX 25 мм / F1.4 II АСФЕРИЧЕСКИЙ. (H-XA025) 1,1 Нажмите здесь 08 июня 2021 г.
    LEICA DG NOCTICRON 42,5 мм / F1,2, АСФЕРИЧЕСКИЙ / POWER O.I.S (H-NS043) 1,3 Нажмите здесь 27 сентября 2017 г.
    LEICA DG MACRO-ELMARIT 45 мм / F2.8 АСФЕРИЧЕСКИЙ / MEGA O.I.S. (H-ES045) 1,1 Нажмите здесь 08 декабря 2015 г.
    LEICA DG ELMARIT 200 мм / F2,8 / POWER O.I.S. (H-ES200) 1,2 Нажмите здесь 08 июня 2021 г.

    Обновление прошивки объективов Panasonic (Four Thirds)

    Название модели

    вер.

    Описание

    Выпуск

    LEICA D SUMMILUX 25 мм / F1,4, АСФЕРИЧЕСКИЙ (L-X025) 2,1 Нажмите здесь 15 октября 2008 г.


    Обновление прошивки для SIGMA Линзы (Micro Four Thirds)

    Название модели

    вер.

    Описание

    Выпуск

    30 мм F1.4 DC DN | Современный 1,2 Нажмите здесь 31 января 2017 г.


    Обновление прошивки объективов TAMRON (Micro Four Thirds)

    Название модели

    вер.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.