Автоматическая система дозирования реагентов комплексон 6: Автоматическая система дозирования реагентов КОМПЛЕКСОН-6 (0.5 м3/час, без реагентов) : inhibitors.ru

Автоматическая система дозирования реагентов КОМПЛЕКСОН-6 (0.5 м3/час, без реагентов) : inhibitors.ru

КОМПЛЕКСОН-6-0.5 система дозирования реагентов (0.5 м3/час)

ТУ 3631-001-31599189-96. Сертификат соответствия № РОСС RU.АЮ31.В09712

Автоматическая система дозирования реагентов Комплексон-6 предназначена для обработки подпиточной воды систем теплоснабжения, водооборотных систем и ГВС ингибиторами отложений карбонатов кальция, магния и ингибиторами коррозии, например, марки «Комплексонат ОЭДФ-цинк» или «Комплексонат НТФ-цинк». Ингибирующее действие комплексонатов основано на их избирательной адсорбции на активных центрах зарождающихся кристаллов накипи, что не только препятствует росту новых кристаллов, но и при определенных условиях разрушает старые.

Комплексон-6 работает в автоматическом режиме. Ввод реагента осуществляется насосом-дозатором периодически по сигналу с блока управления. Величина вводимой дозы пропорциональна количеству подпиточной воды, измеренному расходомером на магистрали подпитки.

Технические характеристики

• Расход подпиточной воды:
  • номинальный (усредненный), м3/ч 0.5
  • максимальный,  м3/ч  2.0
• Габаритные размеры ШxГxВ 330x290x800
• Объем расходной емкости, л    25
• Диаметр условного прохода водосчетчика, мм 15
• Напряжение питания 220 V ±15%
• Средняя потребляемая мощность 30 Вт
• Максимальное давление воды в точке ввода реагента
  • стандартное исполнение 0,8 МПа (8 кгс/см2)
  • по заказу 1,2 МПа (12 кгс/см2)
• Предельный перепад давления на узле измерения и впрыска 0,1 МПа (1,0 кгс/см2)
• Основная приведенная погрешность дозирования при номинальных параметрах менее 0,5%
• Основная приведенная погрешность дозирования при колебаниях давления в системе ±0,2 МПа (2 кгс/см2) ±2%
• Насос-дозатор мембранный с электромагнитным приводом
• Клапаны спаренные, самоочищающиеся
• Срок эксплуатации не менее 10 лет

Комплект поставки

Электронный блок управления, насос-дозатор, расходная емкость, водосчетчик с импульсным выходом, устройство ввода реагента, монтажный комплект армированного шланга и провода, комплект техдокументации.

Ингибитор коррозии АСДР Комплексон-6 | Промышленная группа Империя Промышленная группа Империя

Автоматическая система дозирования реагентов «Комплексон-6» предназначена для обработки подпиточной воды систем теплоснабжения, водооборотных систем и ГВС ингибиторами отложений карбонатов кальция магния и ингибиторами коррозии.

АСДР Комплексон-6: принцип действия

Ингибирующее действие комплексонов основано на их избирательной адсорбции на активных центрах зарождающихся кристаллов накипи, что не только препятствует росту новых кристаллов, но и при определенных условиях разрушает старые.

При применении метода комплексонатной водоподготовки:

«Комплексон-6» работает в автоматическом режиме, оборудование занимает мало места и расходуется реагентов в десятки и сотни раз меньше, чем соли; — полностью отсутствуют собственные сточные воды, не требуется постоянный лабораторный контроль, т.к. персонал котельной контролирует работу установки по имеющимся на ней приборам; -реагенты имеют гигиенические сертификаты и могут применяться для ГВС и открытых систем теплоснабжения; — потребляемая мощность менее 30Вт, напряжение 220 Вольт.

Установка дозирования реагентов работает полностью в автоматическом режиме, неметаллоемка, компактна, не требует практически никакого обслуживания от персонала, надежна в реальных условиях эксплуатации.

Основные технические характеристики

Усредненный расход подпитки	Габаритные размеры (мм) ШхГхВ
до 0,5 м³/ч	460х190х340
до 1,5 м³/ч	330х290х800
до 5,0 м³/ч	470х510х950
до 10,0 м³/ч	480х520х1140
до 20,0 м³/ч	570х610х1380
до 40,0  м³/ч	940х940х1220
до 80,0 м³/ч	1350х1350х1280
более 80,0 м³/ч	по запросу

 

Для подбора типоразмера установки Комплексона-6 и состава реагентов от Заказчика необходимо иметь следующую информацию: √ Усредненный расход подпитки в м3/час или м3/сутки; √ Открытая система теплоснабжения или закрытая; √ Максимальную температуру нагрева и состав подпитывающей воды в объеме ГОСТа на питьевую воду или следующие параметры: — рН — содержание железа (мг/дм3) — общая жесткость (мг-экв/дм3) — сульфаты (мг/дм3) — щелочность или карбонатная — мутность или содержание — жесткость (мг-экв/дм3) взвешенных веществ.

 

В комплект поставки Комплексон-6 включается: блок управления и дозирования с расходной емкостью, водосчетчик с импульсным выходом, устройство ввода реагента, монтажный комплект армированного шланга и провода, разовая заправка реагентом Эктоскейл-450-1 (цинковый комплекс НТФ 20%-ный раствор), комплект техдокументации.

 

Для последующей заправки системы потребуется приобрести реагент Эктоскейл дополнительно.

 

 

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

 

 

Промышленная группа предприятий «Котлы Алтая» Дозирование реагентов

Водоподготовка для котельных путем дозирования реагентов.

КОМПЛЕКСОН-6 

Автоматическая система дозирования реагентов «Комплексон-6» предназначена для обработки подпиточной воды систем теплоснабжения, водооборотных систем и ГВС ингибиторами отложений карбонатов кальция магния и ингибиторами коррозии.
Метод комплексонатной водоподготовки принципиально отличается тем, что с помощью специально подобранных реагентов не удаляются из воды накипеобразующие элементы, а устраняются их накипеобразующие свойства.

Ингибирующее действие комплексонов основано на их избирательной адсорбции на активных центрах зарождающихся кристаллов накипи, что не только препятствует росту новых кристаллов, но и при определенных условиях разрушает старые.

Установка дозирования реагентов работает полностью в автоматическом режиме, неметаллоемкая, компактна, не требует практически никакого обслуживания от персонала, надежна в реальных условиях эксплуатации.

При применении метода комплексонатной водоподготовки:

• «Комплексон-6» работает в автоматическом режиме, оборудование занимает мало места и расходуется реагентов в десятки и сотни раз меньше, чем соли;
• полностью отсутствуют собственные сточные воды, не требуется постоянный лабораторный контроль, т.к. персонал котельной контролирует работу установки по имеющимся на ней приборам;
• реагенты имеют гигиенические сертификаты и могут применяться для ГВС и открытых систем теплоснабжения;
• потребляемая мощность менее 30Вт, напряжение 220 Вольт.

Организация комплексонатной водоподготовки осуществляется по принципиальной схеме, приведенной на рисунке. Ввод реагента осуществляется насосом-дозатором (поз.1) периодически по сигналу с блока управления (поз.2). Величина вводимой дозы пропорциональна количеству подпиточной воды, измеренному расходомером (поз.5) на магистрали подпитки (поз.6).

1-насос дозатор,
2-блок управления,
3-линия впрыска реагента,
4-линия сигналов от расходомерного устройства,
5-расходомерное устройство и узел впрыска,
6-магистраль подпитки,
7-запорная арматура,
8-датчик давления,
9-циркуляционный насос,
10-потребитель.

Усредненный расход подпитки	Максимальный кратковременный расход подпитки	Габаритные размеры (мм) : ширина*глубина*высота
до 0,5 м3/ч	до 3,0 м3/ч	400*350*800
до 1,5 м3/ч	до 7,0 м3/ч	500*500*1400
до 5,0 м3/ч	до 16,0 м3/ч	700*700*1400
до 10,0 м3/ч	до 40,0 м3/ч	700*700*1400
до 20,0 м3/ч	до 80,0 м3/ч	700*700*1400

В комплект поставки входит: установка Комплексон-6 в сборе (пункты 1-4), счетчик воды (пункт 5), канистра с реагентом для разовой заправки, паспорт, инструкция по эксплуатации.              

КОМПЛЕКСОН-7 

Системы водоподготовки “Комплексон-7” предназначены для противонакипной и противокоррозионной обработки воды путём дозирования в подпиточную воду ингибиторов накипеобразования и коррозии, реагентов для химического обескислороживания, а также для проведения химических очисток теплоэнергетического оборудования путём дозирования комплексонов. Дозирующие устройства “Комплексон-7” обеспечивают приближенное поддержание постоянной пропорции дозирования при изменении расхода подпиточной воды в пределах до 10 м3/час. Принцип действия систем водоподготовки «Комплексон-7» основан на том, что при движении подпиточной воды через секционированное сужающее устройство возникает перепад между давлением воды в трубопроводе и сужающем устройстве, который пропорционален квадрату расхода воды. Под действием этого перепада давления жидкий реагент истекает из резервуара через калиброванный жиклер и поступает в поток воды. Расход реагента пропорционален корню квадратному из величины перепада давления. Следовательно, расход реагента прямо пропорционален расходу воды.

Устройства “Комплексон” рекомендуются для противонакипной и противокоррозионной обработки воды, а также для периодических очисток теплоэнергетического оборудования в водогрейных котельных мощностью до 1 ГКал/час, преимущественно в бюджетных организациях образования, здравоохранения, местного самоуправления и социальной защиты населения. Могут быть использованы также в индивидуальных котельных и теплопунктах, в транспортабельных энергетических установках.
 
ТЕХНИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

Наименование характеристик	Значение
Условный проход, мм	25,32 или 50
Рабочее давление, МПа (кгс/см2), не более	не более 6
Объём заправки реагента, л	2 или 5
Габаритные размеры, мм, не более, Длина строительная Высота	100 520
Масса (без реагента), кг, не более	8

 

Системы водоподготовки «Комплексон-7» содержат секционированное сужающее устройство 1 и резервуар для реагента 2, сообщающиеся посредством импульсных трубок с кранами 3 и 4. Дренажный кран 5 служит для промывки резервуара перед заправкой реагентом. Для установки системы в подпиточном трубопроводе предусматривают разрыв длиной 110…115 мм. К концам труб приваривают два фланца 6, расстояние между зеркалами которых должно составлять 100±2 мм. Между фланцами устанавливают секционированное сужающее устройство и стягивают фланцы шпильками 7 с шайбами 8 и гайками 9. 

Установка химводоподготовки АСДР «Комплексон-6»

Преимущества Автоматической системы дозирования Комплексон-6

• АСДР “Комплексон-6” работает в автоматическом режиме, оборудование занимает мало места. Реагентов расходуется в сотни раз меньше, чем соли;
• полностью отсутствуют собственные сточные воды, не требуется постоянный лабораторный контроль, т.к. персонал котельной контролирует работу установки по имеющимся на ней приборам;
• С АСДР комплексон-6 поставляется реагент комплексонат Эктоскейл 450-1 канистра 36 кг
• реагенты имеют гигиенические заключения и могут применяться для ГВС и открытых систем теплоснабжения;
• средняя потребляемая мощность менее 30 Вт, напряжение 220 вольт;
• максимальное давление воды в трубопроводе подпитки для стандартного исполнения АСДР “Комплексон®-6” – 0,8 МПа (8 кгс/см2) и 1,2 МПа (12 кгс/см2) – по заказу.

Для подбора типоразмера установки и состава реагентов от Заказчика необходимо иметь следующую информацию: 1. Усредненный расход подпитки в м3/час или м3/сутки; 2. Открытая система теплоснабжения (ГВС) или закрытая; 3. Максимальную температуру нагрева воды в системе (в котле) и состав подпитывающей воды в объеме ГОСТа на питьевую воду или следующие параметры:  рН  /  общая жесткость (мг-экв/дм3)  /  щелочность (мг-экв/дм3)  /  содержание железа (мг/дм3)  /  сульфаты (мг/дм3)  /  мутность или содержание взвешенных веществ.

Расход подпиточной воды		Габар. размеры, Ш*Г*В
номинальный (усредненный)	макси-мальный
Комплексон 6 -0,5 м3/час	2 м3/час	330*290*800
Комплексон 6-1,5 м3/час	4 м3/час	480*520*1140
Комплексон 6-5,0 м3/час	10 м3/час	570*610*1380
Комплексон 6-10,0 м3/час	20 м3/час	570*610*1380
Комплексон 6-20,0 м3/час	40 м3/час	570*610*1380
Комплексон 6-40,0 м3/час	80 м3/час	940*940*1220
Комплексон 6-80,0 м3/час	160 м3/час	1350*1350*1280

Комплект поставки

Расход подпиточной воды номинальный (усредненный)	Ду водо-счётчика *1	Объём расход-ной ёмкости, л	Разовая заправка реагентом *4 кг	Комплект поставки комплексона-6
0,5 м3/час *3	15 *2	25	6	Блок управления и дозирования с расходной емкостью, водосчетчик с импульсным выходом, устройство ввода реагента, монтажный комплект армированного шланга и провода, разовая заправка реагентом Эктоскейл-450-1 (цинковый комплекс НТФ 20%-ный раствор), комплект техдокументации
1,5 м3/час	20 *2	100	25
5 м3/час	40 *2	200	50
10 м3/час	50	200	180
20 м3/час	65	200	180
40 м3/час	80	500	360
80 м3/час	150	1000	360

 

Мы осуществляем доставку Автоматической системы дозирования реагента АСДР  Комплексон-6    до следующих городов Челябинск, Пермь, Когалым, Уренгой, Нягань, Нефтеюганск, Надым, Сургут, Ханты- Мансийск, Тобольск, Новый Уренгой, Курган, Омск, Тобольск, Уфа, Ижевск, Казань, Самара, Саратов, Нижний Новгород, Оренбург, Пенза, Воронеж, Волгоград, Архангельск, Петрозаводск, Тула, Ярославль, Ростов-на Дону, Астрахань, Краснодар, Иркутск, Ангарск, Кемерово, Новокузнецк, Красноярск, Улан-Удэ, Хабаровск, Владивосток, Владикавказ, Пятигорск, Салехард, Владимир ,Новосибирск, и  во многие другие города России ,проверенными автотранспортными компаниями, а так же  ж.д. и авиа транспортом.
Прайс-лист с ценами на АСДР Комплексон-6,  Вы можете заказать, позвонив по телефону в офис нашей компании.

Система дозирования реагентов АСДР Комплексон-6 в Барнауле (Блоки приготовления и дозирования реагентов)

Для обработки подпиточной воды систем теплоснабжения, водооборотных систем и ГВС ингибиторами отложений карбонатов кальция магния и ингибиторами коррозии разработана и серийно изготавливается автоматическая система дозирования реагентов «Комплексон-6».Ингибирующее действие комплексонов основано на их избирательной адсорбции на активных центрах зарождающихся кристаллов накипи, что не только препятствует росту новых кристаллов, но и при определенных условиях разрушает старые.

При применении метода комплексонатной водоподготовки:

— АСДР «Комплексон-6» работает в автоматическом режиме, оборудование занимает мало места и расходуется реагентов в десятки и сотни раз меньше, чем соли;

— полностью отсутствуют собственные сточные воды, не требуется постоянный лабораторный контроль, т.к. персонал котельной контролирует работу установки по имеющимся на ней приборам;

— реагенты имеют гигиенические сертификаты и могут применяться для ГВС и открытых систем теплоснабжения;

— потребляемая мощность менее 30Вт, напряжение 220 Вольт.

Для подбора типоразмера установки и состава реагентов от заказчика необходимо иметь следующую информацию:

1 Усредненный расход подпитки в м³/час или м³ /сутки.

2 Открытая система теплоснабжения или закрытая.

3 Максимальную температуру нагрева и состав подпитывающей воды в объеме ГОСТа на питьевую воду или следующие параметры:

— pH

— общая жесткость, (мг-экв/л)

— щелочность или карбонатная жесткость, (мг-экв/л)

— содержание железа (мг/л)

— сульфаты (мг/л)

— мутность или содержание взвешенных веществ.

Краткое пояснение.

Водосчетчик, входящий в комплект поставки, имеет адаптер, устройство ввода реагентов и монтируется на трубопроводе подпитки. Установка дозирования располагается в удобном для обслуживания месте и соединяется с водосчетчиком двужильным электрическим кабелем (показан пунктиром) и полиэтиленовой трубкой (обозначена индексом «К»). Сигнал о расходе подпиточной воды от водосчетчика подается на блок автоматики и в соответствии с алгоритмом дозирования насос-дозатор по полиэтиленовой трубке подает реагент из расходной емкости в водосчетчик и далее в подпиточную воду. При желании реагент может вводиться непосредственно в обратный трубопровод теплосети или в другие точки системы.

Установки «Комплексон-6»

Описание

Установка «Комплексон-6» представляет собой автоматическую систему дозирования реагентов химводоподготовки (АСДР). Данная установка применяется в качестве системы для водоподготовки подпиточной воды системы теплоснабжения, водооборотных систем и горячего водоснабжения ингибиторами отложений карбонатов кальция, магния и ингибиторами коррозии.

Ингибирующее действие  АСДР «Комплексон-6» основано на их избирательной абсорбции на активных центрах зарождающихся кристаллов, но и при определенных условиях разрушает старые.

Применяя метод комплексонатной водоподготовки установка «Комплексон-6» работает в автоматическом режиме, оборудование занимает мало места и расходуется реагентов, в десятки и даже сотни раз меньше, чем соли. При этом польностью отсутствуют собственные сточные воды, не требуется осуществлять постоянный лабораторный контроль, так как персонал котельной может контролировать работу установки по имеющейся на ней приборам.

 

Принцип работы установки «Комплексон-6»

Получив сигнал с блока управления (2), насос-дозатор (1) вводит необходимое количество комплексоната. Объём вводимой дозы зависит от количества подпиточной воды, контроль над которым производит расходомерное устройство (5) (см. Рис.1) .

 

Рис. 1. Схема установки  «Комплексон-6».

 

Технические характеристики установок  «Комплексон-6»

Обозначение	Усредненный расход подпиточной воды	Максимальный расход подпиточной воды	Габаритные размеры (мм) : ширина*глубина*высота
Комплексон-6 Н-0,5	0,5 м³/ч	2 м³/ч	460*190*340
Комплексон-6 Н-1,5	1,5 м³/ч	4 м³/ч	330*290*800
Комплексон-6 Н-5	5,0 м³/ч	10 м³/ч	470*510*950
Комплексон-6 Н-10	10,0 м³/ч	20 м³/ч	480*520*1140
Комплексон-6 Н-20	20,0 м³/ч	40 м³/ч	570*610*1380
Комплексон-6 Н-40	40,0  м³/ч	80 м³/ч	940*940*1220
Комплексон-6 Н-80	80,0  м³/ч	160  м³/ч	1350*1350*1280
Комплексон-6 Н-….	более 80,0 м³/ч	Для больших объемов подпитки оборудование изготавливается под конкретный заказ (максимальный размер подпитки не ограничен)

 

Для заправки установок «Комплексон-6» применяется специально разработанный реагент «Эктоскейл». Реагент для химводоподготовки «Эктоскейл» может поставляться в двух формах — водный раствор или сухой порошок. Реагенты имеют гигиенический сертификат и могут применяться в системах горячего водоснабжения и открытых системах теплоснабжения.

 

 

 

Примечания: Информация на сайте является ознакомительной. Завод-изготовитель оставляет за собой право вносить непринципиальные изменения и усовершенствования  в  конструкцию вышеуказанного оборудования без  их отражения на данном сайте.

Хорошая герметичная полностью автоматическая установка дозирования

Хорошая герметичная полностью автоматическая установка дозирования Posted in миксеры . Post navigation

Высокопроизводительная автоматическая установка для …

жарко в продаже. 25-180 м³ / ч конкретные бетонные станции, бетонного завода в китае. хорошее качество машин на бетонный завод. высокая урожайность и низкое потребление, дешевый и прочный. неоднократно имитировать …

1-камерная, полностью автоматическая установка приготовления растворов, из сухих и жидких веществ MixLine MX7100. Установка поставляется полностью собраной, проверенной и готовой к …

Установка дозирования реагентов работает полностью в автоматическом режиме, неметаллоемка, компактна, не требует практически никакого обслуживания от …

Aug 13, 2006 · Цех дозирования бетономешалки HZS120.HZS60 Готовый Смешанный бетонный завод.Чжэнчжоу Sincola Мобильный бетонный завод бетонныйБетонный завод HZS35 (автоматическая) купить в Алматы.

Установка дозирования реагентов работает полностью в автоматическом режиме, неметаллоемка, компактна, не требует практически никакого обслуживания от …

Полностью автоматическая установка приготовления раствора kd 440 предназначена для химической обработки воды с помощью известкового молочка или сульфата алюминия.

Установка дозирования жидкого азота (ln2) … — полностью автоматическая подача ln2 … — Герметичная системой трубопроводов для жидкого азота vbc semiflex .

Автоматические установки дозирования КОМПЛЕКСОН-ht. Назначение. Автоматическая установка дозирования КОМПЛЕКСОН-ht предназначен для обработки подпиточной воды теплосети, путем подачи в обрабатываемую воду …

Полностью автоматическая система компьютерного управления plc + scada. Удобная международная транспортировка и монтаж, благодаря стандартным размерам узлов и агрегатов.

1-камерная, полностью автоматическая установка приготовления растворов, из сухих и жидких веществ MixLine MX7100. Установка поставляется полностью собраной, проверенной и готовой к …

Полностью автоматическая система компьютерного управления plc + scada. Удобная международная транспортировка и монтаж, благодаря стандартным размерам узлов и агрегатов.

Установки приготовления и дозирования растворов Комплектные автоматическая установки приготовления и дозирования растворов 1 / 8

Aug 13, 2006 · Окружающая среда Дружественная большая мощность Hzs180 СтационарнаяТип. установка дозирования компонентов бетонной смеси ( бетонный завод).Ёмкость бункера для тонкозернистых материалов, т. 4 …

Автоматическая система точного дозирования i-Dos отмеряет нужное количество моющего средства и помогает вам сэкономить воду и моющее средство. … Раздельная установка температуры возможна …

Установка дозирования жидкого азота (ln2) … — полностью автоматическая подача ln2 … — Герметичная системой трубопроводов для жидкого азота vbc semiflex .

Разливочная автоматическая установка

Автоматическая наполнительная установка afs-1000-4 с укупорщиком av-200 Разливочная и укупорочная автоматическая линия AFS-1000-4 / AV-200 с вытяжкой

Полностью автоматическая система взвешивания и смешивания готовая смесь бетонных заводов 60 м3 / ч для продажи. 120 Cubic sicoma CE HZS120 установка для смешивания бетонных смесей в …

полностью автоматическая конфигурации обеспечивают превосходное удаления органических и неорганических загрязнений.

Установки приготовления и дозирования реагентов — Компания Сенсетек — полный комплекс услуг по обеспечению и проектированию очистных сооружений. Телефон …

Полностью автоматическая и простая в использовании, она специально разработана для того, чтобы уменьшить до минимума вмешательство оператора при …

отредактировал свой пост, добавил фото, за темой так пристально уже и не слежу — как ни зайдешь тут всё одно и то же — фотки с ебея А про диллон никто и не пишет, лучше бы диллон кто-нибудь попостил подробно, в динамике.

Очистка промышленных стоков при использовании химических методов обычно связана с дозированием в загрязненные воды различных флокулянтов или коагулянтов. Они, попадая в сточную воду, вступают с веществами …

QUATTROcare PLUS 2124А — программно-управляемый прибор для чистки, смазки и ухода за четырьмя наконечниками одновременно, KaVo (Германия), купить по низкой цене с доставкой по Москве, Санкт-Петербургу и всей России.

Мобильные водоочистные станции для питьевой воды. Контейнерные мобильные установки для очистки воды являются оптимальным Полностью автоматическая система 3 Резервуар для чистой воды 1 м³ все необходимое …

Автоматическая система дозирования реагентов « Комплексон — 6 » канистра с реагентом для разовой заправки, паспорт, инструкция по эксплуатации. … Установка дозирования …

Установка поставляется заказчику в полностью закрытом исполнении, но в то же время при необходимости обслуживания, все защитные части могут быть с легкостью удалены.

АСДР «Комплексон-6» — автоматическая система дозирования реагентов. Защита трубопровода от накипи и коррозии с помощью ингибиторов коррозии Эктоскейл.

Модели серии dxdk — фасовочные автоматы типа вертикального для высокоскоростного дозирования и автоматической сыпучих упаковки порошкообразных продуктов таких как соль 3 в 1, кофе, сахар, мука, сухое молоко, медицинские, специй порошки и т.п.

Инструкция автоматическая система дозирования реагентов «Комплексон-6&quot. Судя по отсутствию каких-либо выходных данных в «Техни-ческом описании и инструкции» к «Автоматической системе …

Различные компактные системы для дозирования стальной фибры обеспечивают точность взвешивания и качественное разделение фибры при полной автоматизации процессов.

Полностью автоматическая машина для наполнения капсул, …

njp-400c / njp-1200c полностью автоматическая машина для наполнения капсул, своего рода капсулы заполнения оборудования, принимает мульти-отверстия дозирования, прерывистый движение и преобразование частоты сроки.

Рейтинг лучших электрических варочных панелей по соотношению цена-качество в 2019 году по мнению покупателей. Топ-10 лучших варочных панелей электрических.

Автоматические системы дозирования и контроля уровня pH, Rx, концентрации свободного и общего хлора. Анализаторы жидкости. Системы контроля и управления дозированием.

Документ — Боковые стенки камеры миксеры выложены сменяемыми изнашиваемыми плитами (внешние стенки толщиной 15 мм, внутренние — 8 мм), которые установлены до края миксера.

Автоматическая система дозирования реагентов «Комплексон-6» предназначена для обработки подпиточной воды систем теплоснабжения, водооборотных систем и ГВС ингибиторами отложений карбонатов кальция магния и …

Автоматическая система дозирования реагентов (АСДР) Комплексон-6 предназначена для обработки воды, поступающей в системы теплоснабжения, ГВС и ХВС ингибиторами (реагентами).

Установка polycompact pc — это работающая в периодическом режиме станция растворения и дозирования раствора сухого полимера в которой раствор полимера готовится и созревает в двухсекционном аппарате периодического …

Установка дозирования ООО «НТЦ Энергосервис» осуществляет поставки установок дозирования .

1: Хорошая репутация Имея историю развития больше 30 лет, наша компания AIMIX уже экспортировала наши продукты в более чем 80 стран.

Комплексон-6 — это экономичная в применении система дозирования реагентов для водоподготовки и защиты труб от накипи и коррозии. Доставим в любой город РФ.

Вакуумный насос согласно общему технологическому строению создаёт разряжение внутри рабочей цистерны (полностью герметичная установка), вследствие чего происходит эффект всасывания ЖБО по специальному приёмному шлангу.

АВТОМАТИЧЕСКАЯ ЛИНИЯ (ПЕЧЬ, ЖАРОВНЯ) для ЖАРКИ В ПОТОКЕ ГОРЯЧЕГО ВОЗДУХА ceselsan и далее УПАКОВКИ В ПАКЕТЫ (РТ-УМ-24) формируемые из рулона

Энергосберегающая новая передвижная бетоносмесительная установка 60 м3 / ч для продажи с одобренным2016 новый Н тип дробилка челюстиДля продажи и обслуживания за пределами …

Стиральная машина с технологией интеллектуального дозирования моющего средства и …

Проблема дозирования концентратов средств для уборки решается довольно просто и относительно недорого. Установка на предприятии современной автоматической дозирующей системы …

Установка дозирования реагентов ELITE.PR

Каталог оборудования: Станции дозирования реагентов в бассейны: Станция дозации cl и рН equal complet 0505, Станции дозации pool guard, Станция дозации emypool, Установка дозирования реагентов elite.pr , Станция дозирования реагентов elite …

Установка дозирования реагентов работает полностью в автоматическом режиме, неметаллоемка, компактна, не требует практически никакого обслуживания от …

ДОЗИРУЮЩАЯ УСТАНОВКА … два уровня бортов – прошли полностью технический осмотр ГАБАРИТЫ РАМЫ:13,4 х 2,40 х Н 2,55 м … автоматическая остановка дозирования …

Автоматическая передвижная установка для смешивания бетонных смесей. Alibaba china 2016 новые продукты бетономешалка для продажи.Цепь для бетонных конвейеров HZS90.

Продажа Деаэратор вакуумный Servitec Levelcontrol 120 90° арт. 8825600 Reflex 850 898.66 р доставка по Москве и России, помощь в подборе, гарантия — SELLPump-Готовый электрический бетонный завод

Поэтому вам полностью не нужно беспокоиться о пробламой траспорта, если вы купите наши маленькие бетонные завоы.

Аффимерные реагенты как инструменты для диагностики болезней растений

WT CPMV и eVLP имеют одинаковую антигенность

CPMV — это икосаэдрический вирус, состоящий из 60 копий как большой (L), так и малой (S) субъединицы белка оболочки ¹⁶ . CPMV имеет двудольный геном оцРНК (РНК-1, 6 т.п.н. и РНК-2, 3,5 т.п.н.). Каждый из двух геномных сегментов инкапсидируется отдельно, образуя три фракции, названные в соответствии с их седиментационным поведением в градиентах плотности: CPMV-B (оттом) (содержащий более крупную РНК-1), CPMV-M (неактивный) (содержащий РНК-2) и относительно небольшое количество встречающихся в природе пустых частиц (CPMV-T (op)).Белковые компоненты CPMV-B, CPMV-M, CPMV-T и рекомбинантно экспрессируемых пустых VLP (eVLP-CPMV) практически идентичны структурно (рис. 1a) ^13,14,15,16 с единственной существенной разницей. представляет собой степень расщепления удлинения из 24 аминокислот до С-конца субъединицы S, которое происходит во время очистки и хранения частиц ^13,14 . Это расширение расположено в 5-кратных вершинах структуры eVLP-CPMV ¹³ . Поликлональная антисыворотка против CPMV ¹⁷ дикого типа может обнаруживать субъединицы L и S во всех трех формах CPMV дикого типа и eVLP-CPMV (рис.1б). Библиотеку фагового дисплея Affimer ^3,4,5 подвергали скринингу против очищенного eVLP-CPMV, иммобилизованного с использованием связи биотин-стрептавидин, для выделения специфических связывающих веществ. После трех раундов пэннинга 24 случайно выбранных клона тестировали на связывание eVLP-CPMV, а также CPMV дикого типа с использованием фагового ELISA (фиг. 1c). Для подтверждения эффективного связывания эти клоны Affimer тестировали против CPMV дикого типа. Большинство клонов связывало CPMV дикого типа до уровня, сопоставимого с уровнем, наблюдаемым для eVLP-CPMV. Однако два клона (номера 14 и 22) не показали такого связывания с CPMV или eVLP-CPMV и представляют собой ложноположительные результаты процесса скрининга и не были проанализированы в дальнейшем (рис.1в). Были секвенированы семь клонов с наивысшей амплификацией сигнала и, следовательно, наиболее вероятными связывающими веществами с наивысшей аффинностью для CPMV и CPMV-eVLP (помеченных черными звездочками (*), рис. 1c). Анализ последовательности показал, что все семь аффимеров уникальны. Предпосылкой для нашего анализа белков Affimer был выбор вариабельных петель, которые имели значительно отличающуюся последовательность, поскольку сходная последовательность в этой области предполагает, что сайты связывания, скорее всего, идентичны. Три белка Affimer (2, 11 и 24) не были приняты для дальнейшего анализа, поскольку последовательность в их вариабельных петлях была близка к последовательности по крайней мере одного из других секвенированных белков Affimer.Остальные четыре белка Affimer (3, 9, 17 и 23) были выбраны для продукции белка (помечены красными звездочками (*), рис. 1c). Их субклонировали с С-концевой His-меткой в ​​векторы экспрессии pET11 и впоследствии продуцировали в E . coli и очищены для дальнейшего анализа (см. Методы и дополнительный рис. 1а).

Рисунок 1

CPMV дикого типа и eVLP CPMV имеют одинаковую антигенность. ( a ) Наложение опубликованных структур CPMV, 5a33, 5a32, 5FMO, 5MS1, 5MSH.RMSD между этими структурами составляет 0,4. Субъединица Small (S) окрашена в синий цвет, а субъединица Large (L) — в зеленый. ( b ) Гель SDS-PAGE, окрашенный кумасси синим, для демонстрации общей концентрации белка в образцах CPMV по сравнению с вестерн-блоттингом, который демонстрирует, что поликлональная антисыворотка, индуцированная против CPMV дикого типа, выявляет как L-, так и S-субъединицы CPMV-T дикого типа, M и B и eVLP-CPMV с одинаковой эффективностью. ( c ) Фаговый ELISA аффимерных белков из 24 клонов, инкубированных в лунках, содержащих иммобилизованные пустые вирусоподобные частицы (eVLP) (розовый), WT CPMV (синий) и отрицательный контроль (зеленый), показывающий 3,3 ‘, 5 , Поглощение продукта 5’-тетраметилбензидина (TMB) при 620 нм через 2 минуты.Клоны, помеченные черной звездочкой (*), были отобраны как белки Affimer, подходящие для обнаружения как eVLP, так и WT CPMV, и были секвенированы. Клоны, помеченные красной звездочкой, были идентифицированы как белки Affimer с различными последовательностями в вариабельных петлях и использовались для дальнейшего тестирования.

Определение структуры CPMV, связанного с Affimer 3

Для анализа механизма связывания CPMV с реагентом Affimer мы решили определить структуру комплекса Affimer: CPMV с помощью криоЭМ.Первоначально все четыре белка Affimer были проанализированы с использованием отрицательного окрашивания EM в комплексе с CPMV, чтобы найти реагент Affimer, наиболее подходящий для криоЭМ. Был выбран Affimer 3 против CPMV, так как он не вызывал заметной агрегации или слипания частиц CPMV на фильтрах с отрицательным окрашиванием. Был собран набор данных по отрицательному окрашиванию, и в RELION была произведена предварительная 3D-реконструкция. Однако разрешение было недостаточным для визуализации связанного анти-CPMV Affimer 3, вероятно, из-за размера Affimer (11 кДа).

В попытке получить структуру высокого разрешения комплекса Affimer: CPMV, были изготовлены криоЭМ сетки. Смешивание CPMV с анти-CPMV Affimer 3 перед загрузкой на криоЭМ-сетку и замораживание вызывало катастрофическую агрегацию, и полученные сетки не подходили для сбора данных с высоким разрешением ¹⁸ . Чтобы решить эту проблему, CPMV был применен к сеткам из кружевного углерода, покрытым тонким (<3 нм) слоем углерода. Это заставляет частицы CPMV иммобилизоваться на углеродной подложке, впоследствии был нанесен анти-CPMV Affimer 3, избыток раствора был удален, и сетка была окончательно промыта перед блоттингом и погружным замораживанием (более подробную информацию см. В разделе «Методы» и ¹⁸ ).В результате этого метода были получены высококачественные криоЭМ-сетки с равномерно распределенными частицами, которые идеально подходят для сбора данных (рис. 2а). Были собраны данные и составлена ​​карта плотности электромагнитного излучения (см. Методы). Глобальное разрешение полученной структуры составило 3,4 Å (рис. 2, табл. 1). Вирусный капсид имеет самое высокое разрешение (рис. 2c), и предыдущие атомные модели для субъединиц L и S вписываются в плотность с четким разрешением объемных боковых цепей в обоих белках капсида (рис. 2d). Субъединицы L (зеленые) взаимодействуют на оси симметрии 2-го порядка икосаэдрического капсида, и здесь мы можем видеть дополнительную плотность, которая приписывается анти-CPMV Affimer 3 (фиолетовый, рис.3а). Благодаря усреднению икосаэдра, применяемому во время обработки изображений и определения структуры, к этим местоположениям применяется двойная симметрия, которая подходит для вирусного CP, но не для связанного Affimer. В результате структура аффимера, не являющаяся двукратной симметрией, неправильно усредняется, что означает, что нет четкой плотности для скелета аффимера, и мы не можем картировать положение отдельных аминокислот. Это согласуется с тем, что белок Affimer является гибким по сравнению с CP вируса, поскольку разрешение, по-видимому, хуже на «вершине» белка Affimer (рис.2в). Также, похоже, существует разрыв в плотности на «кончике» Affimer, предположительно из-за высокой степени гибкости. Поэтому интерпретировать получившуюся структуру затруднительно. Мы визуализируем реагент Аффимера, связанный с каждой из двадцати двух осей симметрии. Из-за усреднения симметрии трудно определить занятость реагента Affimer на этих сайтах связывания. Плотность ЭМ, приписываемая реагенту Аффимера, не такая сильная, как плотность ЭМ CP, но аналогична плотности, поэтому мы полагаем, что сайты в значительной степени заняты.Плотность ЭМ визуализируется для альфа-спирального домена аффимера с основанием спирали, связанным на границе раздела между двумя L-субъединицами (рис. 3b). Бета-цепи аффимера не видны при высоком разрешении (рис. 3b), что позволяет предположить, что существует некоторая гибкость в связывании аффимера. Если мы проанализируем нерезкую карту плотности EM, которая сохраняет информацию с низким разрешением, плотность, соответствующая β-листу, видна, но нити не разрешены (рис. 3b). Вариабельная петля аффимера является местом молекулярного узнавания, и поэтому эта область должна быть специфически связана с капсидом.Предыдущий структурный анализ Affimer белков показал расположение вариабельной петли (Supplementary Fig. 1b). Из-за расположения переменных петель мы предлагаем, чтобы N-конец реагента Affimer был обращен вниз в капсид, поскольку это позволило бы петлям переменной Affimer связываться с частью L-субъединицы в капсиде CPMV (рис. 3б).

Рисунок 2

Криоэлектронная микроскопия CPMV, связанного с анти-CPMV Affimer 3. ( a ) Репрезентативная микрофотография с коррекцией движения криоЭМ CPMV, связанного с анти-CPMV Affimer 3.Масштабная шкала 100 нм. ( b ) Средние значения класса 2D, рассчитанные в Relion1.4. ( c ) 3D крио-ЭМ реконструкция CPMV, связанного с анти-CPMV Affimer 3, окрашенная с помощью местного разрешения. Область с самым высоким разрешением карты составляет ~ 3,3 Å и расположена у вирусного капсида (синий / зеленый). Элементы с самым низким разрешением карты (> 4 Å) — это связанные белки Affimer анти-CPMV (красный). Ключ показан для справки. ( d ) Типичная криоЭМ плотность для демонстрации плотности боковой цепи в CP.( e ) Кривая корреляции Фурье-оболочки (FSC) маскированной карты, немаскированной карты и скорректированной карты. Приведенное здесь разрешение соответствует критерию 0,143.

Таблица 1 Сбор и обработка данных крио-ЭМ для плотности крио-ЭМ CPMV и анти-CPMV Affimer 3. Рисунок 3

Аффимер 3 против CPMV связывается с CPMV на 2-кратной оси. ( a ) Трехмерная крио-ЭМ реконструкция CPMV, связанного с анти-CPMV Affimer 3. Субъединица CPMV S окрашена в синий цвет, а субъединица L — в зеленый.Дополнительная плотность ЭМ, приписываемая анти-CPMV Affimer 3, показана фиолетовым цветом. Икосаэдрическая (I1) симметрия была наложена во время обработки изображения. Ось 2-го порядка обозначена красной пунктирной линией. ( b ) Увеличено с учетом связанных анти-CPMV Affimer 3 (фиолетовый) видов сбоку и сверху. Кристаллическая структура Affimer (PDB 4N6U) вписывается в плотность. Поскольку анти-CPMV Affimer 3 связан с 2-кратной осью, плотность не визуализируется для бета-цепей из-за усреднения, необходимого для обработки изображений. Карта с повышенной резкостью содержит информацию с высоким разрешением, и только альфа-спиральная часть Affimer может быть визуализирована.Карта без резкости содержит информацию с низким разрешением, на которой можно визуализировать плотность бета-нитей. Ось 2-го порядка обозначена красной пунктирной линией.

Аффимер 3 специфически связывается с CPMV

Для того, чтобы любой связывающий реагент был применим в диагностике, важно, чтобы он не давал ложноположительных результатов. Таким образом, мы исследовали, является ли анти-CPMV Affimer 3 специфичным для CPMV или он распознает сходные структурные особенности других икосаэдрических вирусов.Поэтому мы иммобилизовали равные концентрации (10 мкг / мл) образцов следующих VLP; Норовирус мышей (MNV), вирус спутникового некроза табака (STNV), гепатит B (Hep B) и вирус скручивания листьев картофеля (PLRV) с использованием биотин-стрептавидиновой связи, а также проанализирована способность анти-CPMV Affimer 3 распознавать их с использованием ELISA (рис. 4а). Анти-CPMV Affimer 3 не связывался ни с одним из протестированных вирусов, но показал специфичность в отношении CPMV (как WT, так и eVLP).

Рисунок 4

Аффимер 3 против CPMV специфичен для CPMV.( a ) ELISA иммобилизованных VLP — мышиный норовирус (MNV), вирус спутникового некроза табака (STNV), гепатит B (Hep B) и вирус скручивания листьев картофеля (PLRV), обнаружение с использованием анти-CPMV Affimer 3. Только CPMV и eVLP -CPMV были обнаружены анти-CPMV Affimer 3. (b ) Схема, описывающая сэндвич-ELISA. Анти-CPMV Affimer 3 иммобилизован на планшете maxisorb, если CPMV присутствует, он связывается с анти-CPMV Affimer 3. Биотинилированный анти-CPMV Affimer 3 связывается с капсидом CPMV (если присутствует), который затем связывается со стрептавидин-HRP.HRP окисляет TMB, вызывая изменение цвета, которое отслеживается по оптической плотности. ( c ) Сэндвич-ELISA слепого теста для обнаружения присутствия CPMV в инфицированных листьях. 6 листьев были отрицательным контролем, и 6 листьев были инфицированы CPMV (разведенным до 1 из 5 или 1 из 20). Экстракт листьев номер 2, 4, 5, 6, 9 и 11 был положительным. Эти неочищенные экстракты листьев также показали повышенную абсорбцию, что свидетельствует об успешности метода обнаружения. Планки погрешностей показывают стандартное отклонение от среднего.

Чтобы дополнительно проверить пригодность анти-CPMV Affimer 3 для будущей полевой диагностики, мы проверили способность анти-CPMV Affimer 3 обнаруживать CPMV в неочищенных экстрактах из инфицированных листьев с помощью сэндвич-ELISA (рис. 4b). В поле, если обнаруживается, что растение инфицировано CPMV (или другим растительным вирусом), растение будет уничтожено, чтобы ограничить распространение инфекции на другие растения. Очищенный CPMV использовали в качестве положительного контроля для оптимизации условий ELISA. Сэндвич-ELISA требует двух связывающих реагентов, в данном случае двух реагентов Affimer; «аффимер захвата», который иммобилизован на планшете, и «аффимер обнаружения», который будет связываться с CPMV и вызывать изменение цвета через комплекс биотин-стрептавадин-HRP при добавлении TMB (если присутствует CPMV) (рис.4б). «Аффимер обнаружения» имеет концевую часть цистеина, что позволяет конъюгировать с биотиновым линкером. Биотин используется для обнаружения положительного результата в сэндвич-ELISA, поскольку связанный с цистеином «аффимер обнаружения» будет связываться с CPMV, если он присутствует. Затем «аффимер обнаружения» способен связываться со стрептавидином, связанным с HRP, что вызывает изменение цвета TMB, которое можно контролировать с помощью оптической плотности в планшет-ридере (рис. 4b). «Аффимер захвата» не требует конъюгации с биотином, и поэтому белки аффимера обычно производятся без цистеина.Это означает, что реагенты Affimer легче производить, а отсутствие цистеина полезно во многих последующих экспериментах. Чтобы найти оптимальные параметры для типа захвата аффимера 3 против CPMV (т. Е. Концевого цистеина или «нормального» (нецистеинового) аффимера), определяли концентрацию и время инкубации аффимера 3 против CPMV (дополнительный рисунок 2а). ). При использовании в качестве «захватывающего» реагента, аффимер 3 против CPMV с концевыми группами цистеина показывает повышенный фон по сравнению с нецистеиновым аффимером 3 против CPMV (*, дополнительный рис.2a), поэтому нецистеиновый аффимер 3 против CPMV использовали в качестве «аффимера захвата» в последующих ELISA. Наибольшая абсорбция была достигнута при адсорбции в течение ночи при 4 ° C 50 мкг / мл анти-CPMV Affimer 3 и 0,5 мкг / мл детектируемого анти-CPMV Affimer 3 с концевым цистеином (зеленый прямоугольник, дополнительный рис. 2). Следовательно, для «аффимера захвата» 50 мкг / мл не содержащего цистеина «нормального» реагента аффимера инкубировали в течение ночи при 4 ° C, и 0,5 мкг / мл реагента аффимера с биотинилированным цистеиновым концом использовали в качестве «аффимера обнаружения».Эти условия использовались во всех следующих ELISA. Для извлечения частиц CPMV из инфицированных листьев сравнивали два метода (дополнительный рис. 2b и см. Методы). Мы намеренно старались максимально упростить подготовку листьев без использования научного оборудования. При анализе наиболее разбавленных экстрактов листьев наибольшее поглощение было достигнуто путем ручного измельчения листьев в буфере PBS, поэтому этот метод был использован в последующем анализе.

Слепое тестирование было выполнено, в котором двенадцать листьев были случайным образом пронумерованы 1–12 (6 из которых были инокулированы CPMV, а 6 из которых были неинокулированными отрицательными контролями в слепом эксперименте).Листья были извлечены и проанализированы с использованием оптимизированных условий сэндвич-ELISA, описанных выше (дополнительный рис. 2а). Эту экстракцию и сэндвич-ELISA повторяли три раза, используя каждый раз свежий образец пронумерованного листа (фиг. 4c). ELISA правильно идентифицировал образцы, инфицированные CPMV, при этом значительная абсорбция наблюдалась в инокулированных листьях (листья 2, 4, 5, 6, 9, 11), а низкая абсорбция (т.е. ниже порога оптической плотности 0,2) наблюдалась для отрицательных контроли (листья 1, 3, 7, 8, 10, 12), демонстрирующие, что анти-CPMV Affimer 3 может специфически обнаруживать инфицированные CPMV листья (рис.4в).

Высвобождение активного TGF-β1 из латентного комплекса TGF-β1 / GARP на регуляторных Т-клетках опосредуется интегрином β8

Аннотация

Активированные Т-регуляторные клетки (Tregs) экспрессируют латентный TGF-β1 на своей клеточной поверхности, связанный с GARP . Хотя интегрины участвуют в опосредовании высвобождения активного TGF-β1 из комплекса латентного TGF-β1 и латентного связывающего TGF-β1 белка, их роль в процессинге латентного TGF-β1 из латентного комплекса TGF-β1 / GARP неясна. Мышиные CD4 ⁺ Foxp3 ⁺ Treg, но не CD4 ⁺ Foxp3 ^— Т-клетки, экспрессировали интегрин β ₈ ( Itgb8 ), как определено с помощью количественной ОТ-ПЦР.Экспрессия Itgb8 была маркером тимически производных (t) Treg, поскольку она не могла быть обнаружена на Tregs Foxp3 ⁺ Helios ^— или на индуцированных in vitro Т-клетках Foxp3 ⁺ . Tregs из условных нокаутов Itgb8 проявляли нормальную супрессорную функцию in vitro и in vivo на модели колита, но не обеспечивали TGF-β1 для управления Th27 или индуцированной дифференцировки Treg in vitro. Кроме того, Itgb8 нокаутных Tregs экспрессировали более высокие уровни латентного TGF-β1 на своей клеточной поверхности, что согласуется с дефектным процессингом.Таким образом, интегрин α _v β ₈ является маркером tTreg и функционирует внутренним для клетки образом, опосредуя процессинг латентного TGF-β1 из латентного комплекса TGF-β1 / GARP на поверхности tTreg.

Введение

Активированные Foxp3 ⁺ Т-регуляторные клетки (Tregs) экспрессируют латентный TGF-β1 связывающий белок GARP / LRRC32, который необходим для экспрессии латентного TGF-β1 на поверхности Treg человека и мыши. В системе культивирования in vitro, в которой активированные Treg используются в качестве источника TGF-β1 для стимулирования индуцированной дифференцировки Treg (iTreg) или Th27, GARP необходим для эффективного производства биологически активного TGF-β1 (1).Предыдущие исследования показали, среди других механизмов, что интегрины α _v , α _v β ₆ и α _v β ₈ связывают сайт аргинин-глицин-аспарагиновая кислота (RGD) в латентном TGF. -β1 и способствуют высвобождению биологически активного TGF-β из комплекса латентного TGF-β1 и латентного TGF-β1 связывающего белка (LTBP, большой латентный комплекс). Активация, опосредованная α _v β ₆ , требует взаимодействия его цитоплазматического домена с актиновым цитоскелетом, который, по-видимому, управляет силами сдвига, необходимыми для активации TGF-β1 из большого латентного комплекса (2).Напротив, α _v β ₈ имеет короткий цитоплазматический хвост, который не взаимодействует с актиновым цитоскелетом. Некоторые исследования продемонстрировали, что α _v β ₈ -зависимый процессинг латентного TGF-β1 из большого латентного комплекса требует коэкспрессии матриксных металлопротеаз (MMP), в частности, MMP-14 (или MT1-MMP) (3). Однако неизвестно, является ли это единственной ММП, которая может функционировать в α _v β ₈ -опосредованной активации TGF-β1.

Предыдущие исследования были сосредоточены на процессинге латентного TGF-β1 из большого латентного комплекса интегрином α _v β ₈ на дендритных клетках (DC).Условная делеция Itgb8 из лейкоцитов или только из DC привела к тяжелому воспалительному заболеванию кишечника и возрастному аутоиммунитету (4). Удаление Itgb8 на DC также привело к неспособности управлять эндогенной дифференцировкой Th27 в кишечнике и к неспособности генерировать высокопатогенные клетки Th27 во время экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита, что приводило к заметно более легким симптомам (5). Роль интегринов в процессинге латентного TGF-β1 из латентного комплекса TGF-β1 / GARP менее ясна.Было показано, что α _v β ₆ и в меньшей степени α _v β ₈ активируют латентный TGF-β1 из клеток 293, трансфицированных интегринами α _v , про-TGF-β1 и GARP (6 ). Однако интерпретация этих исследований была осложнена тем фактом, что TGF-β1 одинаково активировался в отсутствие GARP, вероятно, из-за присутствия эндогенного LTBP. Тем не менее оказалось, что способность α _v β ₆ активировать TGF-β1 из латентного комплекса TGF-β / GARP была реальной, поскольку она сохранялась в присутствии ECR3E-фрагмента LTBP, который ингибирует эндогенный LTBP. , но не GARP.Остается неясным, присутствуют ли аналогичные механизмы в Tregs или тромбоцитах, которые физиологически экспрессируют GARP.

Целью настоящего исследования было изучить, как биологически активный TGF-β1 высвобождается из комплекса GARP / латентный TGF-β1 с помощью мышиных Treg. В этом исследовании мы демонстрируем, что интегрин α _v β ₈ является маркером тимических (t) Tregs мышей и функционирует внутренним образом клетки, высвобождая активный TGF-β1.

Материалы и методы

Мыши

C57BL / 6 были получены из репозитория мышей Национального центра института (Фредерик, Мэриленд).Foxp3-GFP, C57BL / 6-Rag1 ^{— / —} и OVA-специфичные TCR-трансгенные мыши OT-II (CD45.1, Rag1 ^{— / —} ) были получены Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний ( NIAID) и поддерживались Taconic Farms (Germantown, NY) по контракту с NIAID. Мыши Itgb8 ^{Fl / Fl} , которые были описаны ранее (7), были получены из Регионального ресурсного центра по мутантным мышам (инвентарный номер MMRRC 014108-UCD). Эти мыши содержат сайтов loxP в 3′- и 5′-интронах экзона 4 гена Itgb8 .Мыши Lrrc32 ^{Fl / Fl} (GARP) и Tgfb1 ^{Fl / Fl} , Ikzf2 ^{Fl / Fl} (Helios) были описаны ранее (1, 8, 9). Флоксированных мышей скрещивали с мышами CD4-CRE (Taconic). Мыши-репортеры Helios-GFP были разработаны Taconic Artemis и будут подробно описаны позже. Мышей-репортеров Helios-GFP скрещивали с мышами Foxp3-mRFP, полученными из лаборатории Джексона (Бар-Харбор, штат Мэн). OVA-специфичные TCR-трансгенные мыши OT-II были получены от Taconic Farms и скрещены с мышами Foxp3-GFP для получения мышей OT-II Foxp3-GFP, как описано ранее (10).Все протоколы для животных, использованные в этом исследовании, были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных NIAID.

Эксперименты по воспалительному заболеванию кишечника

Эксперименты по воспалительному заболеванию кишечника проводились аналогично описанным ранее (11). Вкратце, 4 × 10 ⁵ наивных CD4 ⁺ Т-клеток дикого типа (CD4 ⁺ CD25 ^— CD45RB ^hi ) были перенесены в Rag1 ^{— / —} мышей в присутствии или отсутствие 2 × 10 ⁵ (CD4 ⁺ CD25 ^hi CD45RB ^low ) Tregs от мышей WT или Itgb8 с условным нокаутом (cKO).Вес контролировали два раза в неделю в течение 11 недель.

Выделение клеток и проточная цитометрия

Для очистки ДК селезенки мыши фрагментировали и расщепляли в течение 30 мин при 37 ° C в присутствии либеразы blendzyme II (Roche) и ДНКазы (2 мкг / мл) (Roche) в полном объеме. среда (модифицированная среда RPMI 1640 с добавлением 10% FBS HyClone, 50 мкМ 2-ME (Sigma-Aldrich), 1% пирувата натрия, 1% заменимых аминокислот, 1% HEPES, 100 Ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 2 мМ l-глутамина.Их метили гранулами против CD11c и очищали в сепараторе клеток AutoMACS (Miltenyi Biotec). Т-клетки из объединенных лимфатических узлов и / или селезенки выделяли с использованием шариков CD4.

CD4 ⁺ Foxp3 ⁺ Tregs и Foxp3 ^— обычных Т-клеток (Tconv) были отсортированы из объединенных лимфатических узлов мышей Foxp3-GFP. CD4 ⁺ CD25 ⁺ Treg и CD4 ⁺ CD25 ^— Tconv также были отсортированы. Всю сортировку клеток проводили на проточных цитометрах FACSAria (BD Biosciences).Суспензии единичных клеток окрашивали с использованием следующих антител в соответствии с протоколом производителя: антимышиные CD45.1 (A20), CD45.2 (104), CD4 (RM4-5), Foxp3 (FLK-16s), GARP (YGIC86). ) и IL-17A (eBio17B7). Очищенный мышиный антимышиный клон LAP TW7-16B4 был предоставлен H. Weiner (Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс). LAP Ab был помечен SureLight-APC в Columbia Biosciences (Колумбия, Мэриленд). Для окрашивания Foxp3 клетки фиксировали и повышали проницаемость с использованием набора для окрашивания с фиксацией / проницаемостью Foxp3 (eBioscience).Для окрашивания цитокинов клетки фиксировали и повышали проницаемость с использованием набора Cytofix / Cytoperm от BD Biosciences.

Цитокины и другие реагенты

Рекомбинантный мышиный IL-6 был приобретен у BioLegend (Сан-Диего, Калифорния). Ингибитор ММП GM6001 и контроль GM6001 были приобретены в Santa Cruz Biotechnology (Даллас, Техас).

Тест подавления in vitro

Тесты подавления in vitro проводили, как описано ранее (12).

Дифференцировка Т-клеток in vitro

Для индукции дифференцировки Th27 или iTreg с использованием активированных Treg в качестве источника биологически активного TGF-β1, как описано ранее (1), отсортированные Tregs были активированы и размножены с использованием связанных с планшетом анти-CD3 (1 мкг на лунку, 24-луночный планшет) с ИЛ-2 (100 Ед / мл) в течение 2–3 дней с последующим культивированием в течение ночи только с ИЛ-2.Клетки обычно были> 90–95% Foxp3 ⁺ после размножения. Treg промывали и смешивали 1: 1 с наивными клетками CD45.1 ⁺ OT-II (RAG1 ^{— / —} ) в присутствии рекомбинантного мышиного IL-6 (10 нг / мл) и стимулировали селезеночными DC и растворимыми анти-CD3 на 4 дня. Аналогичные эксперименты были выполнены с использованием экзогенного IL-2 (100 Ед / мл) и активированных Treg для управления дифференцировкой iTreg. Т-клетки, дифференцированные по Th27, стимулировали коктейлем для стимуляции клеток и ингибиторами транспорта белка (eBioscience).

В других экспериментах были дифференцированы iTregs для анализа экспрессии Itgb8. Наивных CD4 ⁺ Т-клеток (CD44 ^low CD62L ^hi ) мышей Foxp3-GFP культивировали со связанными с планшетом анти-CD3 или DC и растворимыми анти-CD3. Наивные клетки CD4 ⁺ также были отсортированы от мышей OT-II Foxp3-GFP и культивированы с DC селезенки и родственным пептидом. Во всех условиях клетки культивировали в присутствии рекомбинантных TGF-β1 и IL-2. Через 4 дня культивирования клетки CD4 ⁺ GFP (Foxp3 ⁺ ) были отсортированы и немедленно подверглись выделению РНК.

Выделение мРНК

, продуцирование кДНК и ПЦР в реальном времени

Treg и обычные CD4 ⁺ Т-клетки были отсортированы и немедленно подвергнуты экстракции РНК или стимулированы в течение ночи с помощью IL-2 и связанных с планшетом анти-CD3, а затем подвергнуты воздействию РНК. экстракция с использованием реактива TRIzol. Затем загрязняющую ДНК удаляли обработкой ДНКазой I. Супермикс SuperScript II First-Strand Synthesis Supermix для количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR; Invitrogen Life Technologies) использовали для создания кДНК.ПЦР в реальном времени проводилась с помощью ABI Prism7900HT с использованием набора Kapa Probe Fast Universal qPCR Kit и TaqMan Probes для GAPDH, ITGB8 и Foxp3.

Результаты

Интегрин α

_v β ₈ является маркером Foxp3 ⁺ Tregs

Предыдущие исследования нашей группы и других показали, что активированные Foxp3 ⁺ Tregs экспрессируют латентный TGF-β1 на своей клеточной поверхности. связан с связывающей молекулой, GARP (1, 13, 14). Хотя было показано, что α _v β ₈ на DC опосредует высвобождение активного TGF-β1 из большого латентного комплекса, мы ранее показали, что даже в отсутствие DC, Tregs способны высвобождать активный TGF-β1. , в первую очередь из латентного комплекса TGF-β1 / GARP (1).Поэтому мы решили изучить потенциальную экспрессию и функцию α _v β ₆ и α _v β ₈ с помощью Tregs. Отсортированные CD4 ⁺ Foxp3 ⁺ выражали значительно более высокие уровни Itgb8 , чем CD4 ⁺ Foxp3 ^— Tconv при qRT-PCR (рис. 1A). Ни один из типов клеток не экспрессировал Itgb6 (данные не показаны). К сожалению, мы не смогли определить экспрессию β ₈ на одноклеточной основе, потому что в настоящее время нет доступных Ab для окрашивания и анализа FACS.Экспрессия Itgb8 не зависела от экспрессии TGF-β1 или GARP (фиг. 1B, 1C). Однако обе клеточные популяции экспрессировали интегрин α _v (CD51) либо в свежевыделенном виде, либо после активации анти-CD3 и IL-2 (дополнительный рисунок 1). CD51, однако, хорошо известен своей способностью спариваться с несколькими β-цепями интегрина в дополнение к β ₈ , включая β ₁ , β ₃ , β ₅ и β ₆ (15).

РИСУНОК 1.

Integrin α _v β ₈ выражается с помощью Foxp3 ⁺ Treg.( A ) Сортированные CD4 ⁺ Foxp3 ⁺ (GFP ⁺ ) и CD4 ⁺ Foxp3 ^— (GFP ^— ) были измерены для сообщений Itgb8 и Foxp3 согласно измерениям q -PCR. Данные выражены относительно клеток CD4 ⁺ Foxp3 ^—. ( B и C ) Отсортированные CD4 ⁺ CD25 ⁺ и CD4 ⁺ CD25 ^— из CD4 cKOs Tgfb1 и Lrrc32 и их CRE ^— контролей были измерены для одного помета99. Сообщение itgb8 .Данные выражены относительно клеток WT CD4 ⁺ CD25 ^—. ( D ) Сортированные CD4 ⁺ Foxp3 ⁺ (GFP ⁺ ) и CD4 ⁺ Foxp3 ^— (GFP ^— ) из селезенки, периферических лимфатических узлов или мезентериальных лимфатических узлов Сообщение Itgb8 , измеренное с помощью qRT-PCR. ( E ) Отсортированные CD4 ⁺ Foxp3 (GFP) ^— и CD4 ⁺ Foxp3 (GFP) ⁺ (в свежем виде или после стимуляции в течение ночи связанными с планшетом анти-CD3 + IL-2), CD11b ⁺ CD103 ^— и CD11b ^— CD103 ⁺ DC из мезентериальных LN и CD11b ⁺ или CD11b ^— DC были измерены для сообщения Itgb8 .Сначала DC были введены в клетки Thy1.2 ^— CD19 ^— CD11c ⁺ I-A ^b-hi .

Itgb8 Экспрессия Tregs не зависела от лимфоидной ткани, из которой были выделены Treg (фиг. 1D), и лишь незначительно увеличивалась при активации (фиг. 1E). Itgb8 экспрессируется в CD103 ⁺ DC в мезентериальных лимфатических узлах или лимфоидных тканях, ассоциированных с кишечником (16, 17). Мы обнаружили, что уровень экспрессии Itgb8 был выше в Treg, чем в CD103 ⁺ DC (относительно GAPDH).Как описано ранее (17), уровень Itgb8 был существенно выше в CD103 ⁺ DC из мезентериальных лимфатических узлов, чем в CD103 ^— DC или популяциях DC из селезенки (рис. 1E).

Интегрин β

₈ выражается в основном с помощью Helios ⁺ Foxp3 ⁺ Tregs

Поскольку мы ранее показали, что iTregs экспрессируют латентный комплекс TGF-β1 / GARP, было интересно определить, экспрессирует ли iTreg также Itgb8 (1).iTreg были получены из наивных CD4 ⁺ Foxp3 ^— Т-клеток от мышей Foxp3-GFP или OT-II Foxp3-GFP. iTreg были получены с использованием связанных с планшетом анти-CD3, селезеночных DC с растворимым анти-CD3 или селезеночных DC с пептидом OVA (клетки OT-II), культивированных в течение 4 дней с IL-2 и TGF-β1, а затем отсортированных на Foxp3 ⁺ (GFP ⁺ ) ячеек. Tregs и клетки Foxp3 ^—, стимулированные связанными с планшетом анти-CD3 + IL-2, культивировали параллельно и сортировали на клетки GFP ⁺ или GFP ^— соответственно.iTregs, созданные с помощью связанных с планшетом анти-CD3, не экспрессировали существенных уровней Itgb8 , равно как и тех, которые генерировались с использованием DC с пептидом. Параллельно культивируемые Treg сохраняли свою экспрессию, тогда как культивируемые клетки Foxp3 ^– не демонстрировали существенной экспрессии. Интересно, что iTreg, генерированные с использованием селезеночных DC и растворимого анти-CD3, действительно демонстрировали некоторую экспрессию Itgb8 , тогда как генерированные с использованием более физиологически релевантных условий с пептидом — нет. Уровень экспрессии iTreg, генерируемых с использованием селезеночных DC и растворимых анти-CD3, был все еще ниже, чем культивируемых Treg (рис.2А). Как мы ранее предположили (9), что Foxp3 ⁺ Helios ⁺ и Foxp3 ⁺ Helios ^— Tregs могут представлять tTreg и периферические Treg, соответственно, для каждого из них была определена относительная экспрессия Itgb8 . населения. CD4 ⁺ Foxp3 ⁺ Helios ⁺ , CD4 ⁺ Foxp3 ⁺ Helios ^— и CD4 ⁺ Foxp3 ^— Helios ^— клеток были выделены из клеток Heliosp (GFP (RFP) мышь с двойным репортером.Только клетки CD4 ⁺ Foxp3 ⁺ Helios ⁺ экспрессировали значительные уровни Itgb8 (фиг. 2B). Кроме того, эта разница в экспрессии сохранялась даже после активации и размножения в течение 4 дней в культуре (рис. 2С). Helios не контролировал экспрессию Itgb8 , потому что Tregs, отсортированные из Ikzf2 (Helios) ^{Fl / Fl} CD4-CRE cKO мышей, сохраняли свою экспрессию Itgb8 (фиг. 2D).

РИСУНОК 2.

( A ) Наивных CD4 ⁺ Т-клеток (CD44 ^низкий CD62L ^hi ) мышей Foxp3-GFP культивировали со связанными с планшетом анти-CD3 (iTreg PB-anti-CD3) или DC и растворимые анти-CD3 (iTreg DC + растворимые анти-CD3).Наивные клетки CD4 ⁺ также были отсортированы от мышей OT-II Foxp3-GFP и культивированы с DC селезенки и родственным пептидом (iTreg OT-II w / DCs + пептид). Во всех условиях клетки культивировали в присутствии рекомбинантных TGF-β1 и IL-2 в течение 4 дней. Для того же эксперимента наивные Т-клетки (Tconvs) или клетки CD4 ⁺ GFP ⁺ (Foxp3 ⁺ ) культивировали на связанных с планшетом анти-CD3 с IL-2 в течение 4 дней. ( B ) Отсортированный CD4 ⁺ GFP (Helios) ^— RFP (Foxp3) ^— , CD4 ⁺ GFP ^— RFP ⁺ и CD4 ⁺ GFP ^{+ +} клеток мышей с двойным репортером были измерены для сообщения Itgb8 .( C ) Отсортированные CD4 + GFP (Helios) -RFP- (Foxp3) ^— , CD4 ⁺ GFP-RFP ⁺ и CD4 ⁺ GFP ⁺ RFP ⁺ ячеек из двойных- Репортерных мышей стимулировали связанным с планшетом анти-CD3 + IL-2 в течение 3 дней, затем отдыхали в течение ночи в IL-2. Затем клетки измеряли на предмет сообщения Itgb8 с помощью qRT-PCR. ( D ) Отсортированные CD4 ⁺ CD25 ⁺ и CD4 ⁺ CD25 ^— из CD4 cKO Ikzf2 и их контрольные контрольные группы CRE ^— были измерены для сообщения Itgb8 .В (A) данные выражены относительно популяции обычных Т-клеток; в (B) данные выражены относительно клеток Helios ^— Foxp3 ⁺ ; в (C) данные выражены относительно расширенной (CD4 ⁺ Foxp3 ^— ) не-Treg популяции; а в (D) данные выражены относительно клеток WT CD4 ⁺ CD25 ^—.

Itgb8 необходим для очистки TGF-β1 от комплекса GARP / латент-TGF-β1

Чтобы исследовать функцию Itgb8 на Tregs, мы вывели CD4-cKO Itgb8 , используя ранее описанные Itgb8 ^{Fl / Fl} мышей (7).При скрещивании с CD4-CRE процентное соотношение субпопуляций тимоцитов (дополнительный рисунок 2, верхние панели , ), включая процентное содержание клеток Foxp3 ⁺ в популяции с единичным положительным результатом по CD4 (дополнительный рисунок 2, нижние панели ) ), были идентичны у однопометников CRE ⁺ и CRE ^— . Процентное содержание CD4 ⁺ Foxp3 ^— и CD4 ⁺ Foxp3 ⁺ Т-клеток на периферии также было идентичным у однопометников CRE ⁺ и CRE ^— (дополнительный рис.2, правые панели ).

Мы предположили, что если α _v β ₈ участвует в активации TGF-β1 из комплекса GARP / латентный TGF-β1, то в отсутствие Itgb8 латентный TGF-β1 будет накапливаться на поверхность трэгов. Свежевыделенные Treg мышей WT и Itgb8 cKO показали аналогичные низкие уровни TGF-β1, латентного на клеточной поверхности, тогда как после активации cKO Tregs показали значительно более высокие уровни латентного TGF-β1, чем активированные Tregs WT (рис.3А, 3Б). Поскольку покоящиеся Tregs экспрессируют более высокий уровень GARP, чем латентный TGF-β1, вполне вероятно, что уровни латентного TGF-β1, вероятно, ограничивают формирование экспрессии комплекса GARP / латентный-TGF-β1 на поверхности клетки. Мыши Itgb8 cKO также экспрессировали более высокие уровни GARP и GARP / LAP двойных положительных клеток (фиг. 3B).

РИСУНОК 3.

Активированные Itgb8 -дефицитные Tregs накапливают на своей поверхности латентный TGF-β1. ( A и B ) Свежевыделенные клетки из объединенных лимфатических узлов и обогащенные CD4 клетки ⁺ от мышей Itgb8 cKO (CD4-CRE) или однопометников CRE ^— стимулировали в течение 48 часов с помощью связанных с планшетом антибиотиков. -CD3 и IL-2, а затем окрашивали на CD4, Foxp3, LAP (или IC) и GARP (или IC).(A) Репрезентативные гистограммы для LAP (латентный TGF-β1) из клеток CD4 ⁺ Foxp3 ⁺ . (B) Графические изображения, показывающие среднюю интенсивность флуоресценции LAP и GARP на клетках CD4 ⁺ Foxp3 ⁺ , а также процент двойных положительных клеток по LAP и GARP.

Itgb8 не требуется для Treg-опосредованного подавления in vitro или in vivo в модели переноса колита

Далее мы определили, требуется ли экспрессия Treg Itgb8 для подавления пролиферации T-эффекторных клеток in vitro.Используя традиционный анализ супрессии Т-клеток, Tregs от однопометников Itgb8, cKO и WT в равной степени подавляли пролиферацию с увеличением соотношения Treg к эффекторным Т-клеткам (рис. 4A). Однако это не было неожиданностью, поскольку ранее нашей группой и другими было показано, что ни экспрессия TGF-β1, ни GARP не требуется для подавления in vitro (1, 8). Затем мы определили, играет ли Itgb8 роль в Treg-опосредованном подавлении в модели переноса колита.Перенос WT CD4 ⁺ CD25 ^— CD45RB ^hi Т-клеток привел к значительной потере веса у реципиентов; и WT, и cKO Tregs в равной степени способны защищать от болезней (рис. 4B). Важно, что через 75 дней после переноса как WT, так и cKO Tregs одинаково поддерживают клетки Foxp3 ⁺ в мезентериальных лимфатических узлах (Fig. 4C, 4D). Этот результат согласуется с предыдущим отчетом (18), который продемонстрировал, что TGF-β1 необходим для подавления воспалительного заболевания кишечника в этой модели, но что источником TGF-β1 не был Treg.

РИСУНОК 4.

Treg мышей Itgb8 cKO обычно подавляют in vitro и in vivo. ( A ) Анализы подавления Т-клеток с использованием отсортированных клеток CD4 ⁺ CD25 ^— от мышей WT в присутствии или в отсутствие возрастающих соотношений Itgb8 WT и KO CD4 ⁺ CD25 ⁺ клеток, как описано ранее (12). ( B ) WT CD4 ⁺ CD25 ^— CD45RB ^hi Т-клетки были перенесены в мышей Rag1 ^{— / —} в присутствии или в отсутствие CD4 ⁺ CD25 ^hi CD45RB 9000regs low WT или Itgb8 cKO и наблюдали за потерей веса до 11 недель.Указаны средние изменения веса пяти мышей в каждой группе. ( C и D ) В конце эксперимента брыжеечные лимфатические узлы окрашивали на CD4 и Foxp3. (C) Типичные образцы лимфатических узлов. (D) Процент клеток CD4 ⁺ , которые были Foxp3 ⁺ у отдельных мышей.

Экспрессия ITGB8 с помощью Tregs необходима для биодоступности активного TGF-β1 из Tregs

Для оценки доступности биологически активного TGF-β1, высвобождаемого из WT, и Itgb8 cKO Tregs, мы использовали систему культивирования in vitro, в которой активировали Treg культивируют с наивными Т-клетками в условиях активации (DC селезенки с растворимым анти-CD3) в присутствии IL-6 или IL-2, чтобы управлять дифференцировкой Th27 или iTreg, соответственно.Ранее мы показали, что TGF-β1, происходящий из комплекса TGF-β1 / GARP, играет важную роль в качестве источника TGF-β1, необходимого для дифференцировки клеток Th27 или iTreg (1). WT, но не Itgb8 cKO, Tregs, способствовали дифференцировке Th27 или iTreg, как измерено по экспрессии IL-17A и Foxp3, соответственно (фиг. 5A, 5B). Тот же результат наблюдался, когда Treg активировались только в течение ночи перед культивированием с наивными клетками (данные не показаны). Чтобы определить, нужно ли экспрессировать комплекс GARP / латент-TGF-β1 и α _v β ₈ на одних и тех же клетках или α _v β ₈ может приводить к высвобождению биологически активного TGF-β1 из комплекс GARP / латентный TGF-β1 на другой клетке, мы культивировали Tregs от мышей GARP ( Lrrc32 ) cKO или Itgb8 cKO отдельно или вместе с наивными Т-клетками в анализе дифференцировки Th27.Ни GARP, ни клетки Itgb8 cKO по отдельности не могли эффективно управлять дифференцировкой Th27, однако при смешивании они были способны существенно восстановить дифференцировку Th27, что указывает на то, что α _v β ₈ , экспрессируемый на одной клетке, может приводить к активации TGF-β1. от комплекса GARP / латент-TGF-β1 на отдельной клетке (фиг. 5C, 5D). Предыдущие исследования показали, что интегрин α _v β ₈ , экспрессируемый линиями эпителиальных клеток человека, требует коэкспрессии MMP, в частности MMP-14 (3), для активации латентного TGF-β1 из большого латентного комплекса.Вклад MMP-14 был продемонстрирован при использовании ингибитора MMP GM6001. До сих пор мы не наблюдали никакого эффекта этого ингибитора в широком диапазоне доз на Treg-опосредованную индукцию Th27 до 20 мкМ по сравнению с контролем-носителем или GM6001-контролем (фиг. 5E). Однако важно отметить, что неизвестно, какие ММП экспрессируются Tregs и зависит ли от ММП, опосредованная α _v β ₈ активация латентной активации TGF-β1 комплексом GARP / латентный TGF-β1. .

РИСУНОК 5.

Treg-опосредованная дифференцировка Th27 требует активации латентного TGF-β1 через интегрин α _v β ₈ . ( A ) Наивные клетки CD45.1 ⁺ OT-II мышей Rag1 ^{— / —} были активированы растворимыми анти-CD3 в присутствии IL-6, селезеночных ДК и предварительно активированных CD4 ⁺ CD25 ⁺ Т-клеток от Itgb8 мышей cKO (CD4-CRE) или CRE ^— однопометников. Клетки реактивировали коктейлем для стимуляции клеток и ингибиторами транспорта белка, а затем окрашивали на CD4, CD45.1, CD45.2 и IL-17A. Процент клеток IL-17A ⁺ , полученных из клеток CD4 ⁺ CD45.1 ⁺ CD45.2 ^— в культуре, показан на каждой панели. ( B ) То же, что и в (A), за исключением присутствия IL-2 (100 Ед / мл). Культуру окрашивали на CD4, CD45.1, CD45.2 и внутриклеточно на Foxp3. ( C и D ) Та же культура, что и в (A), за исключением использования предварительно активированных CD4 ⁺ CD25 ⁺ Т-клеток от мышей Itgb8 или Lrrc32 cKO или CRE ^— однопометников.На правой панели половина CD4 ⁺ CD25 ⁺ Т-клеток была от мышей Itgb8 cKO, а половина — от мышей Lrrc32 cKO. (D) Гистограмма показывает среднее (± стандартное отклонение) дубликатов в эксперименте из (C). ( E ) То же, что в (A), за исключением использования отсортированных клеток CD4 ⁺ Foxp3 ⁺ от репортерных мышей Foxp3-GFP и связанных с планшетом анти-CD3 для активации клеток в культуре. Клетки культивировали в присутствии контроля носителя (ДМСО), ингибитора ММП GM6001 или контроля GM6001 и измеряли содержание IL-17A, как в (A).

Helios

^{— / low} Tregs менее эффективны при производстве биологически активного TGF-β1

Поскольку мы обнаружили, что Tregs Helios ⁺ экспрессируют значительно более высокие уровни Itgb8 (рис. 2B), мы хотели оценить способность Helios ⁺ по сравнению с Helios ^{— / низкие} Tregs для управления дифференцировкой Th27 в той же экспериментальной установке, что и на рис. 5. При использовании связанных с планшетом анти-CD3 для активации клеток в культуре Helios ⁺ Tregs более эффективно управляли дифференцировкой Th27 (рис.6A, 6C), чем Helios ^{— / low} Tregs. Этот результат согласуется с более высоким уровнем экспрессии Itgb8 на клетках Helios ⁺ . Это происходит не из-за неспособности клеток Helios ^{— / low} экспрессировать латентный TGF-β1 на своей поверхности, потому что общие Tregs, активированные in vitro при стробировании на подгруппах Helios ^{— / low} или Helios ⁺ , оба аналогичные уровни латентного TGF-β1 на их поверхности (рис. 6D). Также остается возможным, что Helios ^{— / low} Tregs могут обрабатывать латентный TGF-β1 по механизму, не зависящему от _v β ₈ .Удивительно, но когда сокультуры были активированы с использованием растворимых анти-CD3 с селезеночными DC, и Tregs Helios ⁺ и Helios ^{— / low} были одинаково способны управлять дифференцировкой Th27 (фиг. 6B, 6C). Поскольку селезеночные DC не смогли восстановить биологически активную продукцию TGF-β1 из Itgb8 KO Treg (рис. 5A), маловероятно, что низкие уровни Itgb8 на DC вносят вклад в активацию TGF-β1, но вместо этого это происходит. возможно, что DC действуют как платформа для обеспечения тесной близости между Treg и наивными Т-клетками, что приводит к снижению порога концентрации TGF-β1.В результате более низкие уровни биологически активного TGF-β1, продуцируемого Helios ^{— / low} (фиг. 6A, 6C), достаточны для обеспечения полного ответа в присутствии DC (фиг. 6B, 6C).

РИСУНОК 6.

Helios low / — клетки менее эффективны в производстве биологически активного TGF-β1. Наивные CD45.1 ⁺ клетки OT-II мышей Rag1 ^{— / —} были активированы связанными с планшетом ( A ) или растворимыми ани-CD3 ⁺ ДК селезенки в присутствии IL-6 и предварительно активированных Helios. ⁺ или Helios ^{— / low} клеток от мышей с двойным репортером Helios (GFP) / Foxp3 (RFP).Через 4 дня клетки реактивировали коктейлем для стимуляции клеток и ингибиторами транспорта белка, а затем окрашивали на CD4, CD45.1, CD45.2 и IL-17A. Процент клеток IL-17A ⁺ , полученных из клеток CD4 ⁺ CD45.1 ⁺ CD45.2 ^— в культуре, показан на каждой панели. ( C ) Гистограмма показывает среднее (± стандартное отклонение) дубликатов в эксперименте из (A) и ( B ). ( D ) Treg активировали в течение 48 часов, а затем окрашивали на CD4, Foxp3, Helios и LAP.Показанные гистограммы представляют экспрессию LAP на клетках CD4 ⁺ Foxp3 ⁺ Helios ^hi и CD4 ⁺ Foxp3 ⁺ Helios ^{— / low} по сравнению с изотипическим контролем.

Обсуждение

TGF-β1 имеет решающее значение для поддержания иммунного гомеостаза, поскольку делеция TGF-β1 приводит к генерализованному воспалительному синдрому и аутоиммунитету. T- и B-лимфоциты играют критическую роль в развитии заболевания у мышей TGF-β1 ^{— / —} , поскольку воспаление не развивается у мышей TGF-β1 ^{— / —} на фоне SCID (19).

Почти каждый тип клеток экспрессирует рецепторы TGF-β1, но TGF-β1 всегда продуцируется в неактивной форме, связанной с LAP, что предотвращает его связывание с его рецептором. Активация TGF-β1 строго регулируется, поэтому его эффекты могут опосредоваться в подходящей среде. Был предложен ряд механизмов активации TGF-β1, включая плазмин, матриксные металлопротеазы, лизосомальные протеазы и тромбоспондин. Недавние исследования показали, что с физиологической точки зрения интегрины являются ключевыми активами TGF-β1.Самым убедительным доказательством этого является то, что мыши с одноточечной мутацией в последовательности RGD LAP, которая не может связываться с интегринами, фенотипически копируют мышей с глобальным дефицитом TGF-β1 (20).

Хотя 6 из 24 интегринов могут связывать латентный TGF-β1 через последовательность RGD в LAP, только α _v β ₃ , α _v β ₅ , α _v β ₆ и Было продемонстрировано, что α _v β ₈ высвобождает активный TGF-β1. Ряд исследований показал, что α _v β ₆ и α _v β ₈ являются ключевыми активаторами TGF-β1 in vivo.Интегрин α _v β ₆ в первую очередь экспрессируется в эпителиальных клетках, а у мышей β6 ^{— / —} развиваются воспаление легких и кожи, а также эмфизема легких (21). Цитоплазматический домен α _v β ₆ соединяется с актиновым цитоскелетом, а активация TGF-β1, опосредованная α _v β ₆ , контролируется сокращением клеток (2). Напротив, α _v β ₈ широко экспрессируется многими различными типами клеток, включая нейроны, астроциты, эпителиальные клетки дыхательных путей, фибробласты, DC и Т-клетки.Цитоплазматический домен α _v β ₈ не соединяется с актиновым цитоскелетом. Похоже, что роль этого интегрина заключается в том, чтобы представить латентный TGF-β1 мембраносвязанной протеазе, что приводит к высвобождению активного TGF-β1 (3). Неясно, использует ли α _v β ₈ различные механизмы для активации TGF-β1 в разных типах клеток.

Хотя большинство типов клеток способны секретировать латентный TGF-β1, связанный с LTBP, в виде большого латентного комплекса, Treg и тромбоциты экспрессируют уникальный связывающий TGF-β1 белок, GARP, который направляет латентный TGF-β1 на поверхность клетки (1, 13 , 14).Внутри иммунной системы экспрессия α _v β ₈ на лейкоцитах, особенно CD103 ⁺ DC, по-видимому, имеет решающее значение для образования активного TGF-β1 из большого латентного комплекса (4). В этом отчете мы продемонстрировали, что Itgb8 избирательно экспрессируется на tTreg и опосредует высвобождение активного TGF-β1 из латентного комплекса TGF-β1 / GARP. В отличие от латентного комплекса TGF-β1 / GARP, экспрессия которого заметно повышается во время активации Т-клеток, экспрессия Itgb8 на Tregs была конститутивной и лишь умеренно повышалась во время активации.

На данный момент мыши с селективным дефицитом GARP на Т-клетках не обнаруживают признаков спонтанного аутоиммунного заболевания или воспаления в каком-либо органе. Точно так же мыши с делецией β ₈ в Т-клетках CD4 ⁺ не имели фенотипа (4). Напротив, у мышей, у которых только на DC отсутствует α _v или β ₈ , развивается системный аутоиммунитет и колит, а также может быть нарушен выработка Treg (4, 16). Кроме того, у мышей со специфическим для миелоидных клеток дефицитом β8 наблюдается снижение количества клеток Th27 и они защищены от экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (5).Важно отметить, что одна и та же миелоидная клетка должна и представлять Ag, и экспрессировать интегрин. Неясно, почему экспрессия α _v β ₈ на клетках на DC так важна для поддержания иммунного гомеостаза, в то время как потеря экспрессии α _v β ₈ на Treg не приводит к дефекту в иммунная регуляция, по крайней мере, в устойчивом состоянии. Одна возможность состоит в том, что количество DC, которые экспрессируют α _v β ₈ , намного больше, чем количество α _v β ₈ , экспрессирующих Treg, и что они гораздо более широко распределены в организме.Однако это явно не так, потому что экспрессия α _v β ₈ сильно ограничена кишечными CD103 ⁺ DC, а экспрессия α _v β ₈ не обнаруживается на DC селезенки (16). Наиболее вероятное объяснение различных фенотипов β8 ^{— / —} DC и Т-клеток состоит в том, что DC постоянно подвергаются воздействию большого латентного комплекса в местах, где они достигают его во внеклеточном матриксе. Кроме того, в кишечнике усиление индукции Th27 может модулироваться микрофлорой кишечника, а индукция Treg может усиливаться за счет продукции ретиноевой кислоты CD103 ⁺ DC.Напротив, хотя Tregs экспрессируют относительно высокие уровни α _v β ₈ (рис. 1), Tregs экспрессируют только латентный комплекс TGF-β1 / GARP при активации, и условия, приводящие к экспрессии этого комплекса in vivo, еще не определены. быть определенным.

Остается неясным, почему Tregs должны экспрессировать второй путь доставки и активации TGF-β1 на своей клеточной поверхности. Мы продемонстрировали, что активный TGF-β1, производный от Treg, может играть роль как в дифференцировке клеток iTreg, так и клеток Th27.Tregs могут в первую очередь проявлять свои эффекты через распознавание аутоантигенов в процессе праймирования и дифференцировки наивных Т-клеток на поверхности Ag-презентирующих DC. Вероятно, что не все DC экспрессируют Itgb8 и что внутренняя экспрессия Treg Itgb8 может потребоваться для облегчения активации экспрессируемого Treg латентного TGF-β1 во время примирования / дифференцировки наивных Т-клеток. В зависимости от состава воспалительной среды (IL-2 по сравнению с IL-6), активный Treg-производный активный TGF-β1 будет затем способствовать инфекционной толерантности [существующие Tregs, приводящие к дифференцировке Treg de novo (22)] за счет генерации iTreg или способствовать развитию индукция потенциально регуляторных или патогенных клеток Th27.

Раскрытие информации

У авторов нет финансового конфликта интересов.

Благодарности

Мы благодарим Джули Эдвардс и Кэрол Генри из отдела проточной цитометрии NIAID за сортировку наших клеток.

Сноски

• Работа выполнена при финансовой поддержке Программы очного обучения Национального института аллергии и инфекционных заболеваний.

• Онлайн-версия статьи содержит дополнительные материалы.

• Сокращения, использованные в этой статье:

  cKO

  условный нокаут

  DC

  дендритная клетка

  Itgb8

  интегрин β ₈

  0

  0

  0

  09

  LAP

  ассоциированный с латентностью пептид

  LTBP

  латентный TGF-β-связывающий белок

  MMP

  матриксная металлопротеиназа

  NIAID

  Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний 910R в реальном времени ПЦР

  RGD

  аргинин-глицин-аспарагиновая кислота

  Tconv

  обычная Т-клетка

  Treg

  Т-регуляторная клетка

  tTreg

  Treg

  91 дикого типа, полученная из тимов.

• Получено 30 апреля 2014 г.
• Принято 16 июля 2014 г.

Вспышка пороха

Принадлежности и принадлежности для дульнозарядного устройства Black Powder для продажи в Buffalo Arms Co. | Черный порох, расходные материалы для черного пороха, аксессуары, Дульный загрузчик и принадлежности. Пороховые рожки и фляги, пули, чистящие средства для круглых шариков, зазубрины, скребки, патчи для чистки, продукты Ted Cash, флаконы с порошком, патч-червяки, возможные пакеты и многое другое! BUTTERCUP — это закрепляющий порошок AMAZON’S CHOICE.Он полностью совместим со вспышкой и не дает белого оттенка и не становится пепельным при ярком освещении, селфи или фотографиях. Он впитывает масло, уменьшает блеск и сохраняет матовость лица в течение нескольких часов. Используйте для выделения, закрепления / запекания основы или в качестве пудры для всего лица.

Вспышка порошка Вспышка порошка — это взрывчатка, используемая во всех фейерверках и воздушных бомбах большого салюта. Хотя есть много разных формул Flash Powder, самый безопасный (и отраслевой стандарт) …- Переверните банку вверх дном и дважды постучите по основанию, чтобы высыпать порошок.- С помощью двусторонней кисти для ухода за кожей Bake & Blend (продается отдельно) или спонжа Basic B (продается отдельно) нанесите обильный слой пудры под глаза, Т-зону, линии смеха, внешние уголки рта и подбородок. -Дайте пудре запекаться от трех до пяти минут.

15 июня, 2015 · Страница 1 из 2 — флэш-порошок нитрата калия. не такой кричащий. — написано в Chemistry: так что я совершенно новичок в APC Шон. Я заинтересован в создании собственного фейерверка. iv получил дым и вспыхнул. (мигает случайно с этим последним миксом) Я могу сделать несколько отличных ракет.но также слышал, что вы можете делать некоторые отчеты и с нитратом калия. Итак, я попробовал смесь 5 нитрата калия, 3 серы, 2 … Что такое эффекты Райкова? Стадный инстинкт — еще одна особенность отношений лидер-последователь, на которую указывает нейробиология. Ваши эмоции …

Алюминиевый порошок — сферические частицы размером 500 меш (30 микрон) без покрытия. Используется в формулах с медленной вспышкой и блеском, ракетном топливе, порошковых покрытиях и пигментах, катализаторах химической реакции, сварке и любых других проектах / процессах, требующих высококачественного алюминиевого порошка.SRA033 — Вспышка порошка Эта демонстрация представляет собой вариант дополнительной оценки риска CLEAPSS SRA002 — Взрывы пыли с использованием кукурузного крахмала, заварного крема, сахарной пудры, порошка ликоподия и т. Д. Поскольку демонстрация проводится не в замкнутом пространстве, не происходит взрыва, а просто вспышка .

Чувствительность к удару некоторых мгновенных порошков не имеет значения, потому что большая часть процесса горения происходит слишком далеко от фронта реакции, чтобы выдержать ударную волну.