Полиакриламид гель: Полиакриламид-гель. «ХИМПЭК» — Крупный поставщик химического сырья и реагентов для всех отраслей промышленности и агропромышленного комплекса

Содержание

Полиакриламид-гель. «ХИМПЭК» — Крупный поставщик химического сырья и реагентов для всех отраслей промышленности и агропромышленного комплекса

Наименование показателя Норма для ТУ 2216-042-07510508-2009
Полиакриламид-гель водоканальный
Высший сорт
Норма для ТУ 2216-042-07510508-2009
Полиакриламид-гель водоканальный
1 сорт
Внешний вид Гелеобразная вязкая масса от светло-желтого до голубого или зеленого цвета Гелеобразная вязкая масса от светло-желтого до голубого или зеленого цвета
Массовая доля основного вещества, %, не менее 6 5
Кинематическая вязкость раствора полиакриламида-геля с массовой долей 0,25% в растворе хлористого натрия с массовой долей 3% , при 30° , мм²/с не менее 3,0 2,2
Скорость осаждения по оксиду меди, мм/с, не менее 8,0 4
Массовая доля остаточного акриламида в расчете на 1% основного вещества, % не более
Массовая доля остаточного акриламида на 1 кг основного вещества, мг, не более 250 250

Требования безопасности

Класс опасности по степени воздействия на организм человека 4
Виды опасности
Взрыво- и пожароопасность Полиакриламид-гель не горюч, не взрывоопасен.
Опасность для человека Пути попадания полиакриламида-геля в организм человека: при проглатывании. При попадании на кожу и слизистые оболочки глаз, при вдыхании.
Средства индивидуальной защиты При ра боте с полиакриламидом –гелем необходимо пользоваться средствами индивидуальной защиты: защитной спецодеждой по ГОСТ 27574 и ГОСТ 27575, резиновыми перчатками по ГОСТ 20010.

Гарантийный срок хранения продукта — 6 месяцев со дня изготовления.

Полиакриламид-гель водоканальный предназначен для очистки воды в хозяйственно-питьевом водоснабжении и для обесцвечивания рассола на солевыварочных предприятиях.

Полиакриламид-гель получают полимеризацией акриламида, синтезированного на биокатализаторе, с использованием окислительно-восстановительных инициаторов.

Полиакриламид гель — производство и поставки

Полиакриламид гель или ПАА — это технический гель с широкой сферой применения. По своему химическому составу является сополимером полиакриламида и содержит около 10% акрилатов.

Химическая формула Полиакриламида:
-(CH-CH(CONh3))-n

Внешний вид:
Желеобразные гранулы светло-жёлтого цвета

Полиакриламиды делятся на три типа: неионные, анионные и катионные. Неионные используют для очистки сточных и природных вод, а так же для обезвоживания осадков в бумажной промышленности. Анионные ПАА используют для водообработки, в добывающей и текстильной промышленностях, обработке бумаги. Катионные полимеры служат для обработки бумаги и коагуляции клеток в биологии.  

Где используется полиакриламид гель

  • Очистка воды. Полиакриламид – эффективный и недорогой флокулянт. В этом качестве его используют для очистки питьевой или технологической воды. С помощью полиакриламида так же очищают от загрязнений природные водоемы. 
  • Благодаря высоким адсорбирующим свойствам полиакриламида его широко применяют для изготовления средств женских средств личной гигиены, памперсов, салфеток и т.п. Эти же свойства вещества позволяют использовать его при добыче, обогащении и регенерации таких полезных ископаемых как золото, титан, уран, железо, алюминий, каменный уголь. 
  • Полиакриламид гель технический используется для анализа биологических систем.
  • В бумажной промышленности полиакриламид используется для повышения качества бумаги.
  • В строительстве: для улучшения качества цемента и строительных плит.
  • В сельском хозяйстве: в качестве структурообразователя почв, а так же в качестве пленкообразователя для удобрений, инсектицидов и семян.

Производство и сертификация

ПАА производят традиционным химическим способом – путем гидролиза нитрила акриловой кислоты СН2=СН—СN с последующей полимеризацией. Продукт, получаемый на выходе, и есть полиакриламид – гель серовато-желтого цвета, традиционной для геля желеобразной вязкой консистенции.

Полиакриламид гель технический не имеет закрепленного ГОСТа, а потому производится по ТУ (техническим условиям). Согласно им, качественный ПАА должен иметь следующие показатели:

Показатель / Сорт

высший

№1

№2

Массовая доля основного составляющего вещества

6%

6%

5%

Вязкость раствора ППА с МД 0,25 % в растворе NaCl с массовой долей 3% при 30 °С, мм/с, не менее

4,6

3,0

2,2

Скорость выпадения осадка (измеряется по оксиду меди), мм/с

12

8

4

Массовая доля остаточных мономеров акриламида  на 1% основного вещества, не более

0,0025 

 0,0025

0,0025

Требования безопасности и хранение

Полиакриламид гель не горюч; невзрывоопасен. Рекомендуется хранить в крытых помещениях в закрытой таре; не допускать воздействие тепла и прямых солнечных лучей во избежание высыхания вещества. 

Гарантийный срок хранения:
4 месяца.

Купить полиакриламид можно в форме белого или желтоватого порошка или в виде геля белого цвета. Наибольшее распространение полиакриламид получил как коагулянт. В связи с этим многие муниципальные учреждения используют для очистки воды именно полиакриламид, цена его зависит от производителя и объема тары, но в целом полиакриламид считается одним из самых доступных флокулянтов. 

 

Заказать полиакриламид гель

 

Фото полиакриламид гель на складе

 

Следующий реагент

Праестол

Полиакриламид гель аммиачный (мешки 45кг)

ПРИМЕНЕНИЕ ПОЛИАКРИЛАМИДА-ГЕЛЯ:

Полиакриламид гель технический марки Аммиачный предназначен для использования в качестве флокулянта для эффективной очистки природных и сточных вод, улавливания и выделения ионов тяжелых металлов и токсичных веществ, а также для длокуляции в горнохимической, угольной, газо- и нефтедобывающей промышленности, черной и цветной металлургии, для предприятий целлюлозно-бумажной и текстильной отраслей промышленности, в производстве шпатлевок и водоэмульсионных красок.

КАЧЕСТВЕННЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПОЛИАКРИЛАМИДА-ГЕЛЯ:

Наименование показателя Норма Высший сорт Первый сорт Второй сорт

Массовая доля основного вещества, %, не менее665
Кинематическая вязкость раствора полиакриламида с массовой долей 0,25 % в растворе хлористого натрия с массовой долей 3% при 30 0 С, мм?/с, не менее4,63,02,2
Скорость осаждения по оксиду меди, мм/с, не менее128 4
Массовая доля остаточных мономеров в расчете на 1% основного вещества, не более 
— акриламида 
— суммы непредельных соединений

0,0025 
0,025

0,0025 
0,025

0,0025 
0,025

РАБОТЫ С ПОЛИАКРИЛАМИД ГЕЛЕМ

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ:

Полиакриламид гель не опасен (не горюч, не взрывоопасен), 4-й класс опасности.

ХРАНЕНИЕ:

Хранят полиакриламид-гель аммиачный в закрытых складских помещениях при температуре не выше + 35°С в закрытой таре во избежание высыхания.

УПАКОВКА:

Упаковывают полиакриламид в трехслойный мешок: полиэтиленовый, вложенный в бумажный, вложенный в полипропиленовый по 45 кг . Укладка в один ряд стоя. ЖД Вагон 20 т, Еврофура 16-20 т.

Гарантийный срок хранения полиакриламида-геля — 4 месяца со дня изготовления.

Полиакриламид-гель технический

Полиакриламид-гель технический

  • ТУ 6-01-1049-92
  • Описание Полиакриламид-гель технический: Информация отсутствует.

Применение Полиакриламид-гель технический: Полиакриламид-гель технический используют для:

  • подготовка питьевой воды;
  • очистка сточных вод;
  • осветление хвостовых вод флотации;
  • целлюлозно-бумажное производство;
  • и для других целей.

Упаковка Полиакриламид-гель технический: Информация отсутствует.

Транспортирование Полиакриламид-гель технический: Полиакриламид-гель технический транспортируют железнодорожным, автомобильным или речным транспортом.

Хранение Полиакриламид-гель технический: Гарантийный срок хранения полиакриламид-геля технического — 6 месяцев.

Безопасность Полиакриламид-гель технический: Информация отсутствует.

Цена Полиакриламид-гель технический: Низкая стоимость, а также скидки в зависимости от объема закупаемого товара.

Оформление и отгрузка Полиакриламид-гель технический : Благодаря отлаженной работе офиса и складов, мы предоставляем быстрое оформление и отгрузку товаров.

Доставка Полиакриламид-гель технический: Мы предлагаем доставку товаров по России:

  • автотранспортом;
  • железнодорожными контейнерами, вагонами;
  • через транспортные компании.

Для получения подробной информации о ценах на товары и условиях поставки звоните нашим специалистам по телефонам: (383) 279-12-43, 279-17-37, 279-16-30.

Также вы можете купить Полиакриламид-гель технический через интернет-магазин компании ОАО Реактив:

Полиакриламид-гель — СОЮЗХИМПРОМ

 

 

 

 

 

 

 

 

Физико-химические показатели

Наименование показателяНорма для ТУ 2216-042-07510508-2009
Полиакриламид-гель водоканальный
Высший сорт
Норма для ТУ 2216-042-07510508-2009
Полиакриламид-гель водоканальный
1 сорт
Внешний видГелеобразная вязкая масса от светло-желтого до голубого или зеленого цветаГелеобразная вязкая масса от светло-желтого до голубого или зеленого цвета
Массовая доля основного вещества, %, не менее65
Кинематическая вязкость раствора полиакриламида-геля с массовой долей 0,25% в растворе хлористого натрия с массовой долей 3% , при 30° , мм²/с не менее3,02,2
Скорость осаждения по оксиду меди, мм/с, не менее8,04
Массовая доля остаточного акриламида в расчете на 1% основного вещества, % не более
Массовая доля остаточного акриламида на 1 кг основного вещества, мг, не более250250

Требования безопасности

Класс опасности по степени воздействия на организм человека4
Виды опасности
Взрыво- и пожароопасностьПолиакриламид-гель не горюч, не взрывоопасен.
Опасность для человекаПути попадания полиакриламида-геля в организм человека: при проглатывании. При попадании на кожу и слизистые оболочки глаз, при вдыхании.
Средства индивидуальной защитыПри ра боте с полиакриламидом –гелем необходимо пользоваться средствами индивидуальной защиты: защитной спецодеждой по ГОСТ 27574 и ГОСТ 27575, резиновыми перчатками по ГОСТ 20010.

 

Что такое полиакриламидный гель?

Полиакриламидный гель представляет собой раствор, обычно используемый при электрофорезе, процессе разделения молекул или частиц разных размеров путем пропускания их через гель и подачи электрического тока. Существуют разные рецепты для полиакриламидного геля, но обычно он содержит акриламид, воду, буфер, персульфат аммония (APS) и тетраметилэтилендиамин (TEMED). Этот гель действует как матрица, которая разделяет соединения на основе их заряда и размера; чем больше акриламида в растворе геля, тем лучше разделение более мелких молекул. Обычно этот гель используется для разделения белков и ДНК.

При электрофорезе электрическое поле заставляет заряженные частицы проходить через гель, который функционирует как сито, заставляя частицы разных размеров отделяться. Гель будет поглощать тепло, выделяемое электрическим током. Полиакриламидный гель обычно используется в этих процедурах, но агароза, другое химическое вещество, которое создает аналогичный гель, также может быть использована.

Гели могут быть изготовлены с различной концентрацией, причем количество акриламида составляет от 6 до 15%. При смешивании геля акриламид неполимеризуется, что означает, что он остается в виде отдельных молекул. Добавление других химических веществ, способствующих связыванию, таких как TEMED, заставляет молекулы соединяться вместе, образуя длинные цепи — «поли» часть полиакриламида.

Основным преимуществом полиакриламидного геля является то, что количество связующих связей и твердость можно контролировать на основе начального количества добавленного акриламида и ТЕМЕД. Основным фактором концентрации акриламида является размер анализируемой молекулы. Чем меньше разделяемые соединения, тем больше требуется акриламида; очень маленькие частицы отделяются, используя самую высокую концентрацию, 15 процентов.

Акриламид работает, контролируя количество трения в геле; Твердость геля определяет величину трения. Соединения, которые являются большими, будут проходить через гель медленнее, поскольку, естественно, из-за их размера больше трения или сопротивления. Меньшие соединения движутся быстрее, так как меньше трения. Чтобы предотвратить смещение мелких соединений с геля, добавляется больше акриламида для создания большего трения.

ДНК-полиакриламидный гель используется для разделения нитей ДНК различной длины. Части ДНК будут отделяться всего одним нуклеотидом, соединениями, составляющими каждую цепь. Чтобы узнать, какие части относятся к определенным размерам, стандарт, который содержит фрагменты известного размера, обычно запускается вместе с образцами. Затем кусочки ДНК сравнивают со стандартом и определяют размер цепи.

Аналогичная процедура используется для определения размера белков, чаще всего в крови. Кровь содержит два основных типа белка: глобулин, белок большого размера, и сывороточный альбумин, очень маленький, отрицательно заряженный белок. Разделение с использованием полиакриламидного геля используется для определения количества каждого типа.

ДРУГИЕ ЯЗЫКИ

Полиакриламид-гель

  Полиакриламид-гель представляет собой сополимер полиакриламида с акрилатами при содержании последних не более 10%.
Производят технический полиакриламид из нитрила акриловой кислоты СН2=СН-CN, который при гидролизе в присутствии серной кислоты дает акрил-амид и частично акриловую кислоту. Избыток серной кислоты нейтрализуют аммиаком и затем полимеризуют. Получают соответственно так называемый «амиачный полиакриламид», содержащий акрилат аммония. Конечный продукт полиакриламид-гель — прозрачная желеобразная вязкая масса или гранулы от светло-желтого до голубого или зеленого цвета.
Аммиачный полиакриламид — 5-6% полимера, 14-18% сульфата аммония и не более 0,1% нерастворимых веществ.

Химическая формула: (CH-CH(CONH2))-n

Применение полиакриламида-геля.
Полиакриламид-гель используется:
— в качестве флокулянта в золотодобывающей, угольной, химической, целлюлознобумажной отраслях промышленности;
— для вытеснения нефти из пластов в нефтедобывающей промышленности;
— для стабилизации взрывчатки, в скважинах, при взрывных работах в горнодобывающей промышленности;
— для шлихтования основ и отделки тканей в текстильной промышленности;
— в качестве структурирующей добавки в сельском хозяйстве;
— при бурении скважин, в качестве клея, для очистки воды в хозяйственно-питьевом водоснабжении.

Физико-химические показатели полиакриламида-геля.:
Наименование показателяНорма для сорта
ВысшийПервыйВторой
Массовая доля основного вещества, %, не менее6,06,05,0
Кинематическая вязкость раствора полиакриламида-геля с массовой долей 0,25% врастворе хлористого натрия с массовой долей 35 при 30 °С, мм²/с, не менее4,63,02,2
Скорость осаждения по оксиду меди, мм/с, не менее1284
Массовая доля остаточных мономеров в расчете на 1% основного вещества, %, неболее:
акриламида
суммы непредельных соединений

0,0025
0,025

0,0025
0,025

0,0025
0,025

Требования безопасности полиакриламида-геля.
Полиакриламид гель не опасен, не горюч, не взрывоопасен. По степени воздействия на организм человека полиакриламид-гель относится к 4 классу опасности.

Упаковка, транспортировка и хранение.
Упаковывают полиакриламид в трехслойный мешок: полиэтиленовый, вложенный в бумажный, вложенный в полипропиленовый.
Транспортируют железнодорожным, автомобильным или речным транспортом, в соответствии с правилами перевозки грузов, действующими на данном виде транспорта при условии предохранения продукта от атмосферных осадков.
Хранят полиакриламид-гель в закрытых складских помещениях при температуре не выше 35 °С в закрытой таре во избежание высыхания.
Гарантийный срок хранения полиакриламида-геля — 4 месяца со дня изготовления.

ООО “ФАСТЕХ” осуществляет поставки химической продукции со склада в Белгороде в сроки и по доступным ценам, на выгодных для Вас условиях.

 

Полиакриламидный гель – обзор

15.1.3.1 Электрофорез в полиакриламидном геле

Полиакриламидные гели основаны на принципе свободнорадикальной полимеризации акриламида и сшивании N , N ′-метилен-бис-акриламида. Этот материал физически очень стабилен и прочен. Он особенно используется для электрофоретического разделения белков малого или среднего размера (примерно до 1×10 6 Да). Его взаимодействие с мигрирующими молекулами находится на самом низком уровне.Разделяющая способность этого геля зависит от размера разделяемой молекулы, а также от концентрации акриламида и бис-акриламида. Полимеризация акриламида и бис-акриламида с низкой концентрацией предпочтительна для приготовления гелей с большими порами для образцов с высокой молекулярной массой. Отличие электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) от гельпроникающей хроматографии заключается в том, что небольшие молекулы движутся быстрее в полиакриламидных гелях по сравнению с более крупными молекулами (Sadeghi et al., 2006). Стандартный гель, используемый для разделения белков, обычно содержит около 7,5% полиакриламида.

Размер пор в полиакриламидных гелях определяют по значениям % T [общее процентное содержание полиакриламида (вес/объем)] и % C bis [отношение бис к мономеру (вес/вес)] с использованием следующие формулы:

%T=Акриламид(г)+Бис(г)Объем(мл)×100

%Cбис=Бис(г)Акриламид(г)+Бис(г)×100

СТРАНИЦА имеет разные названия по типу геля (трубчатый и пластинчатый гель-электрофорез или непрерывный и прерывистый гель-электрофорез), положению геля (вертикальный и горизонтальный гель-электрофорез), химическому составу геля (нативный и додецилсульфат натрия (ДСН), гель-электрофорез) и распределение пор геля (гомогенный и градиентный гель-электрофорез) (Wenk and Fernandis, 2007).

В пробирочном ПААГ используются стеклянные трубки (10 см × 6 мм), в которые заливается гель, и достигается полимеризация. Гелевую трубку помещают вертикально между двумя разными буферными запасами. Катод обычно располагается в верхней части, а анод — в нижней части. Поскольку большинство биологических материалов заряжены отрицательно, они движутся к аноду. Следовательно, анализируемый образец наносится на верхнюю часть геля с красителем слежения, и через систему пропускают электрический ток.Поскольку следящий краситель движется быстрее, чем соединения в образце, ток прекращается, когда он достигает конца геля, гель вынимают из пробирки и окрашивают.

Гель-таблетки используются чаще, чем колонки, поскольку они позволяют анализировать множество образцов в одной и той же поддерживающей среде (в одинаковых условиях). Полиакриламидный гель готовят между двумя стеклянными пластинами (рис. 15.2). Пластиковая гребенка, помещенная на верхнюю часть геля во время полимеризации, позволяет формировать небольшие лунки в геле.После полимеризации гребенку удаляют, лунки промывают буфером для удаления солей и неполимеризованного акриламида. Кассета с гелем помещается между двумя буферами; образцы помещают внутрь лунок и пропускают ток. Гель окрашивается соответствующим образом в конце электрофореза для визуализации.

Рисунок 15.2. Принципиальная схема электрофореза в полиакриламидном геле.

Анионный детергент SDS используется в SDS-PAGE для денатурации белков, окружающих основной скелет полипептидов, а также для придания отрицательного заряда молекулам (Černý et al., 2013). Скорость движения полипептидов в этом методе зависит от молекулярной массы, а также внутренних электрических нагрузок. Таким образом, этот метод часто используется для определения молекулярной массы применяемых образцов. Образец белка с неизвестной молекулярной массой наносят рядом с белком с известной молекулярной массой на тот же гель, а затем электрофоретически разделяют по разным линиям. Сравнение полос на геле после окрашивания дает представление о молекулярной массе белка.Кроме того, также возможно определить молекулярную массу путем математической оценки результатов этого разделения (Righetti et al., 2001).

В электрофорезе можно использовать две разные буферные системы: непрерывную и прерывистую . В системе непрерывного действия имеется только один разделительный гель; один и тот же буфер используется в резервуарах и геле. Тогда как в прерывистой системе используется двусторонний гелевый препарат с разными буферами. «Стекерный» гель с его крупнопористой структурой расположен на верхней стороне геля, обеспечивая порядок наносимого образца по размеру.Тогда как «разделяющий» гель с мелкими порами расположен на нижней стороне геля и, таким образом, обеспечивает более чувствительное разделение образца. Буферы, используемые при приготовлении гелей, отличаются друг от друга. Кроме того, баковые буферы готовятся иначе, чем гелевые буферы, что позволяет достичь лучшего разделения. Градиентные гели также используются для обеспечения этой функции. Концентрация акриламида постепенно увеличивается в градиентных гелях по мере спуска от верхней части геля.Таким образом обеспечивается постепенное уменьшение пор в геле по мере продвижения вниз. Полипептиды с близкими молекулярными массами в этом типе геля разделяются более эффективно и образуют более четкие полосы (Bolt and Mahoney, 1997).

Принцип и метод электрофореза в полиакриламидном геле (SDS-PAGE)

SDS-PAGE — это аналитический метод разделения белков на основе их молекулярной массы.

Принцип

Когда белки разделяют электрофорезом через гелевую матрицу, более мелкие белки мигрируют быстрее из-за меньшего сопротивления со стороны гелевой матрицы.Другие факторы, влияющие на скорость миграции через гелевую матрицу, включают структуру и заряд белков.

В SDS-PAGE использование додецилсульфата натрия (SDS, также известного как лаурилсульфат натрия) и полиакриламидного геля в значительной степени устраняет влияние структуры и заряда, а белки разделяются исключительно на основе длины полипептидной цепи.

SDS представляет собой детергент с сильным эффектом денатурации белка и связывается с белковой цепью при постоянном молярном соотношении.В присутствии SDS и восстанавливающего агента, который расщепляет дисульфидные связи, необходимые для правильной укладки, белки разворачиваются в линейные цепи с отрицательным зарядом, пропорциональным длине полипептидной цепи.

Полимеризованный акриламид (полиакриламид) образует сетчатую матрицу, пригодную для разделения белков типичного размера. Прочность геля позволяет легко обращаться с ним. Электрофорез белков, обработанных SDS, в полиакриламидном геле позволяет исследователям легко, недорого и относительно точно разделять белки в зависимости от их длины.

Процедура


Подготовка образцов ※Пример, выполненный в MBL
Пошаговая процедура
Добавьте буфер для образцов к образцам и перемешайте, взмахнув пробиркой.

Нагревать образцы при 100°C в течение 3 минут в термоблоке.

Центрифугировать при 15 000 об/мин в течение 1 минуты при 4°C и использовать супернатант для SDS-PAGE.


Электрофорез в полиакриламидном геле — PubMed

doi: 10.1101/pdb.prot100412.

Элемент в буфере обмена

Майкл Р. Грин и соавт.Протокол Колд-Спринг-Харб. .

Показать детали Показать варианты

Показать варианты

Формат АннотацияPubMedPMID

дои: 10.1101/pdb.prot100412.

Элемент в буфере обмена

Полнотекстовые ссылки Параметры отображения цитирования

Показать варианты

Формат АннотацияPubMedPMID

Абстрактный

Сшитые цепи полиакриламида можно использовать в качестве электрически нейтральных гелей для разделения фрагментов двухцепочечной ДНК по размеру и одноцепочечной ДНК по размеру и конформации.Полиакриламидные гели имеют следующие три основных преимущества перед агарозными гелями: (1) их разрешающая способность настолько велика, что они могут разделять молекулы ДНК, длина которых отличается всего на 0,1% (т. е. 1 п.н. из 1000 п.н.). (2) Они могут вместить гораздо большее количество ДНК, чем агарозные гели. До 10 мкг ДНК можно нанести на одну прорезь (1 см × 1 мм) типичного полиакриламидного геля без существенной потери разрешения. (3) ДНК, извлеченная из полиакриламидных гелей, чрезвычайно чиста и может использоваться для самых сложных целей (например,г., микроинъекция эмбрионов мыши). Однако недостатком полиакриламидных гелей является то, что их сложнее приготовить и обрабатывать, чем агарозные гели. Здесь представлены методы приготовления и использования неденатурирующих полиакриламидных гелей и обнаружения ДНК в этих гелях путем окрашивания.

© 2020 Лабораторное издательство Колд-Спринг-Харбор.

Похожие статьи

  • Универсальная микротехнологическая платформа для электрофореза двухцепочечной и одноцепочечной ДНК.

    Угаз В.М., Лин Р., Сривастава Н., Берк Д.Т., Бернс М.А. Угаз В.М. и др. Электрофорез. 2003 янв; 24 (1-2): 151-7. doi: 10.1002/elps.2003. Электрофорез. 2003. PMID: 12652585

  • Обнаружение радиоактивной ДНК в полиакриламидных гелях.

    Грин М.Р., Сэмбрук Дж. Грин М.Р. и др. Протокол Колд-Спринг-Харб. 2020 1 декабря; 2020 (12).doi: 10.1101/pdb.prot100420. Протокол Колд-Спринг-Харб. 2020. PMID: 33262237

  • Новые типы крупнопористых полиакриламидно-агарозных матриц смешанного слоя для электрофореза ДНК: оценка размера пор по графикам Фергюсона фрагментов ДНК.

    Киари М., Д’Алезио Л., Консонни Р., Ригетти П.Г. Киари М. и др. Электрофорез. 1995 авг.; 16(8):1337-44. doi: 10.1002/elps.11501601221. Электрофорез. 1995. PMID: 8529594

  • Электрофорез ДНК в агарозных гелях, полиакриламидных гелях и в свободном растворе.

    Стеллваген Северная Каролина. Стеллваген Северная Каролина. Электрофорез. 30 июня 2009 г. Приложение 1 (Приложение 1): S188-95. doi: 10.1002/elps.2002. Электрофорез. 2009. PMID: 19517510 Бесплатная статья ЧВК. Рассмотрение.

  • Краткий обзор других известных методов обнаружения белков на акриламидных гелях.

    Куриен Б.Т., Скофилд Р.Х. Куриен Б.Т. и др. Методы Мол Биол. 2012;869:617-20. doi: 10.1007/978-1-61779-821-4_56. Методы Мол Биол. 2012. PMID: 22585527 Бесплатная статья ЧВК. Рассмотрение.

термины MeSH

  • Акриловые смолы / химия*
  • ДНК / выделение и очистка
  • Электрофорез, полиакриламидный гель / инструменты
  • Электрофорез, полиакриламидный гель / методы*
  • Концентрация ионов водорода
  • Окрашивание и маркировка / методы
[Икс]

Укажите

Копировать

Формат: ААД АПА МДА НЛМ

Электрофорез в полиакриламидном геле, как это работает, варианты методик и их применение

Гель-электрофорез является основным методом в лабораториях биологических дисциплин, позволяющим разделять макромолекулы, такие как ДНК, РНК и белки.Различные разделительные среды и механизмы позволяют более эффективно разделять подмножества этих молекул, используя их физические характеристики. В частности, для белков методом выбора часто является электрофорез в полиакриламидном геле (PAGE).

В этой статье мы рассмотрим, как работает PAGE, как его можно интерпретировать и некоторые его приложения.

Что такое электрофорез в полиакриламидном геле и что такое электрофорез белков?

СТРАНИЦА — это метод разделения макромолекул, таких как белки, на основе их электрофоретической подвижности, то есть способности аналитов двигаться к электроду с противоположным зарядом.В PAGE это определяется зарядом, размером (молекулярной массой) и формой молекулы. Аналиты перемещаются через поры, образованные в полиакриламидном геле. В отличие от ДНК и РНК, заряд белков различается в зависимости от включенных в них аминокислот, что может влиять на то, как они работают. Аминокислотные цепочки также могут образовывать вторичные структуры, влияющие на их видимый размер и, следовательно, на то, как они могут проходить через поры. Поэтому иногда бывает желательно денатурировать белки перед электрофорезом, чтобы линеаризовать их, если требуется более точная оценка размера.


Поры, образующиеся в полиакриламиде, меньше, чем в агарозе, используемой для электрофореза в агарозном геле. Это делает его более подходящим для разделения белков на больших полинуклеотидных фрагментах ДНК или РНК и позволяет разделять относительно небольшие белки. Следовательно, когда люди ссылаются на «электрофорез белков », они чаще всего имеют в виду метод разделения, который называется PAGE.

SDS PAGE по сравнению с нативным PAGE

PAGE можно проводить в денатурирующих или неденатурирующих условиях, в зависимости от цели анализа.


Анионный детергент, додецилсульфат натрия (SDS), в сочетании с нагреванием и иногда с восстанавливающим агентом, используется для денатурации белков перед электрофоретическим разделением в процессе, известном как SDS PAGE . Тепло разрушает водородные связи, удерживающие вторичные и третичные структуры, в то время как восстановитель, такой как β-меркаптоэтанол, расщепляет дисульфидные мостики. Белки линеаризуются и образуют комплексы с SDS, поэтому все они имеют одинаковое отношение массы к заряду. При этом исключается влияние структуры и заряда, и белки разделяются исключительно на основании различий в их молекулярной массе (рис. 1).Эта система была разработана Ульрихом К. Лэммли под номером 1 и обычно используется для разделения белков молекулярной массой 5–250 кДа.


Рис. 1: Линеаризация белков для SDS PAGE. Дисульфидные связи восстанавливаются β-меркаптоэтанолом, в то время как SDS сводит на нет различия в соотношении массы и заряда, так что белки разделяются на основе молекулярной массы.


В нативном PAGE, 2 эти связи остаются нетронутыми, сохраняя структуру белка более высокого порядка. Следовательно, на распределение белков через гель в основном влияет заряд белка (определяемый его аминокислотной последовательностью и посттрансляционными модификациями) и рН разделения, а не его размер в кДа.Однако это позволяет исследователям анализировать белки в их естественном или «нативном» состоянии. Это может быть желательно при анализе связанных белков или комплексов, например, когда важно, чтобы их биологическая активность оставалась неизменной. Поскольку целью здесь является сохранение естественного состояния белка, SDS, восстанавливающие агенты и тепло не используются при подготовке образцов, а для разделения также могут использоваться более низкие напряжения.


Как работает электрофорез в полиакриламидном геле (PAGE)?

Основной принцип PAGE заключается в разделении аналитов путем пропускания их через поры полиакриламидного геля с помощью электрического тока.Для этого смесь акриламида и бисакриламида полимеризуют (полиакриламид) путем добавления персульфата аммония (АПС). Реакция, катализируемая тетраметилэтилендиамином (TEMED), образует сетчатую структуру с порами, через которые могут перемещаться аналиты (рис. 2). Чем выше процентное содержание общего акриламида в геле, тем меньше размер пор и, следовательно, меньше белков, которые смогут пройти через них. Отношение акриламида к бисакриламиду также влияет на размер пор, но его часто поддерживают постоянным.Меньшие размеры пор также снижают скорость, с которой небольшие белки могут двигаться через гель, улучшая их разрешение и предотвращая их быстрое попадание в буфер при подаче тока.


Рисунок 2: Полимеризация и сшивание акриламида. АПС, катализируемый TEMED, приводит к полимеризации и сшиванию акриламида. Общая концентрация компонентов акриламида и соотношение акриламида к бисакриламиду влияет на размер пор геля и, следовательно, на диапазон размеров белков, которые могут быть разделены.


1. Оборудование


Независимо от типа используемого геля PAGE комплектация оборудования одинакова. Однако, если вы переключаетесь между SDS PAGE и Native PAGE, убедитесь, что все оборудование тщательно очищено, или, если возможно, имейте отдельный набор для каждого типа, чтобы избежать перекрестного загрязнения денатурирующих агентов в нативном анализе. Для изготовления геля необходимы стеклянные пластины, прокладки, гребенка (используемая для создания лунок для образцов) и литейная рамка.Размер прокладок и гребенки будет зависеть от объема и количества образцов, которые вы хотите запустить. Важно, чтобы стеклянные пластины были очищены и тщательно высушены перед сборкой, чтобы предотвратить некачественные гели или утечки при заливке геля. Остатки на основе белка, которые не удаляются, могут испортить гель при окрашивании.


Для запуска геля также потребуются резервуар для электрофореза, блок питания и рама для электрофореза (которая пропускает ток через гель).



2. Буфет


Три категории буфера необходимы для страницы:

  • Бафер для литья геля (используется для создания геля)
  • Буфер для образцов
  • Блок-буфер (заполняет бак гелевой, где электрофорез


Электрофорез может использовать буферную систему непрерывного или периодического действия. 3 Буферная система непрерывного действия имеет только один буфер, используемый для пробы, геля и резервуара с гелем, и редко используется для анализа белка, поскольку разделения имеют тенденцию быть диффузными и плохо разрешаться.В системе прерывистого буфера , наиболее часто используемой для разделения белков, используются разные буферы для геля и подвижного буфера. Используемые гели также включают два слоя (накладывающие и разделяющие гели) с разными размерами пор и разными составами буферов. Прерывистая буферная система имеет тенденцию производить разделение с более высоким разрешением.


Буферы на основе Tris используются для PAGE. Трис-глицин, бис-трис, трис-ацетат и трис-трицин, все с добавлением SDS, используются для SDS PAGE, причем наиболее часто используется трис-глицин.Для нативного PAGE чаще всего используют трис-борат-этилендиаминтетрауксусную кислоту (TBE) без включения SDS. Различия в pH и ионной силе, в дополнение к различному процентному содержанию геля, способствуют прерывистости буферного действия.


3. Гель


Белковый гель состоит из двух частей: накопительного геля и разделяющего геля. Роль накопительного геля заключается в том, чтобы обеспечить загрузку образцов и направить образцы в верхнюю часть разделяющего геля, чтобы все они вошли одновременно.Затем белки в образце будут разделены, чтобы их можно было «разложить» в разделяющем геле . Оптимальный процент геля будет зависеть от размера разделяемых белков. Чем ниже процент, тем больше белков, которые могут пройти. Гель с более низким процентным содержанием (часто около 4% общего содержания акриламида) используется для накопительного геля независимо от размера аналита, поскольку он не обеспечивает разделения. Обычно он имеет более низкий pH (около 6,8 по сравнению с 8,8), чем разделяющий гель, и имеет другое ионное содержание, помогающее сфокусировать аналиты образца в плотную полосу для входа в разделяющий гель.Процент разделяющего геля варьируется в зависимости от размера белков, которые вы хотите разделить, обычно от 7 до 12%. Также могут быть созданы градиентные гели с низким процентным содержанием полиакриламида в верхней части, где входит образец, увеличивающимся по пути образца, так что можно разделить более широкий диапазон размеров белков. Для SDS PAGE буфер, используемый для геля, включает SDS, но для нативного PAGE он не используется.


Сначала наносится разделяющий гель до уровня чуть ниже гребня.После добавления полимеризующих агентов необходимо действовать быстро, прежде чем гель начнет схватываться. Гель следует набрать пипеткой между стеклянными пластинами, избегая попадания пузырьков, а затем сверху налить слой гидратированного изопропилового спирта (IPA), чтобы получить четкие края. Как только растворяющий гель затвердеет, слейте IPA и несколько раз промойте водой. Укладочный гель теперь следует пипетировать сверху и установить гребенку, следя за тем, чтобы не было пузырьков воздуха. После затвердевания гели можно использовать сразу или хранить в холодильнике в герметичном пакете с небольшим количеством воды, чтобы избежать обезвоживания до тех пор, пока они не потребуются.Их можно успешно хранить в течение нескольких дней, даже в течение пары недель, но чем дольше они хранятся, тем больше будет происходить диффузия между двумя слоями геля, и в результате может пострадать разделение.


Готовые гели можно приобрести; однако они, как правило, дороже, чем изготовление самостоятельно.


4. Подготовка проб


Подготовка проб зависит от того, проводите ли вы эксперимент SDS PAGE или нативный PAGE.


Для SDS PAGE образцы, такие как лизированные клетки, ткани или бактерии, смешивают с загрузочным красителем, который содержит ряд важных ингредиентов. Краситель, такой как бромфеноловый синий, позволяет видеть образцы во время загрузки и работы. Глицерин помогает утяжелить образец и предотвратить его всплывание из лунки во время загрузки. SDS и β-меркаптоэтанол линеаризуют присутствующие белки и сводят на нет различия в заряде. Смесь нагревают, часто бывает достаточно 100°C в течение 3 минут, что также способствует денатурации белков.


Для нативного ПААГ SDS и β-меркаптоэтанол не включаются в нагрузочный краситель, и для поддержания белков в их нативной конформации не выполняется этап нагревания.


Перед загрузкой геля образцы центрифугируют (достаточно 16100 x g в течение 2 минут) для удаления нерастворимого мусора. Следует загружать только супернатант, так как твердые частицы могут помешать прохождению образцов по гелю.


5. Контрольные образцы


Маркеры размера обычно располагаются на обоих концах ряда образцов, чтобы можно было оценить размер любых обнаруженных полос.Референтные белки, а также положительные и отрицательные контроли должны быть включены, где это возможно, для проверки наблюдений в неизвестных образцах. Лизат из штамма или клетки, которая, как известно, продуцирует интересующий белок, или очищенный целевой белок, может обеспечить подходящий положительный контроль. Принимая во внимание, что штамм или клеточная линия, такие же, как у неизвестного образца, но в которых удален ген, кодирующий белок-мишень, могут обеспечить подходящий отрицательный контроль. Контроли, которые максимально точно имитируют неизвестные образцы, могут быть особенно полезны при исследовании образцов, которые не являются очищенными белками, поскольку они помогают отличить фоновые полосы от интересующих.


6. Запуск геля


Частично заполните резервуар для электрофореза подходящим рабочим буфером, часто трис-глицин-SDS для SDS PAGE и TBE для нативного PAGE.


Удалите гель (все еще между стеклянными пластинами) с рамки для заливки и вставьте его в рамку для электрофореза. Осторожно опустите его в резервуар для электрофореза и долейте текущим буфером так, чтобы верхние части лунок были погружены в воду. Оставьте гребенку на месте до тех пор, пока вы не будете готовы запустить гель, так как это поможет сохранить целостность лунок.После того, как гребенка удалена, образцы должны быть загружены очень тонким наконечником пипетки или иглой. Будьте осторожны, чтобы не повредить края лунок и не перегрузить их, иначе образцы могут перекрестно контаминироваться между дорожками. Загрузочный краситель в сочетании с образцом помогает визуально направлять этот процесс, а также втягивает смесь образцов на дно лунок.


Установите крышку на резервуар, убедившись, что электроды расположены правильно (черный к черному и красный к красному), и подайте ток на установку.Используемое напряжение и время анализа будут варьироваться в зависимости от процентного содержания используемого разделяющего геля, размера анализируемого вещества и от того, выполняется ли SDS или нативный анализ. Как правило, 200 В в течение 35 минут является хорошей отправной точкой для SDS PAGE и 100 В в течение 40 минут для исходного PAGE (рис. 3). Предварительное охлаждение рабочего буфера для нативного PAGE может помочь предотвратить нагрев образцов, ограничивая денатурацию и повреждение.


Рис. 3: Подготовка пробы к электрофорезу белков в ПААГ. 1) образцы готовятся для анализа, 2) отливаются гели и подготавливается оборудование, 3) буфер добавляется в емкость с гелем, а образцы/контроли добавляются в гель, 4) к образцам подается ток для разделения белков, 5) гели окрашивают и визуализируют.


7. Окрашивание и визуализация


После того, как образцы переместились на достаточное расстояние вглубь геля, что видно по переднему положению красителя, гелевая рамка вынимается из резервуара и осторожно удаляется гель. из стеклянных пластин. Укладочный гель сделал свое дело, его можно аккуратно срезать и выбросить, оставив только растворяющий гель.


Теперь белки должны быть окрашены, что обычно достигается с помощью кумасси бриллиантового синего 4, 5 органического красителя, который образует комплексы с основными аминокислотами, окрашивая белки и фиксируя их на месте.Гели погружают в красящий раствор, обычно состоящий из 20% (об./об.) метанола, 10% (об./об.) ледяной уксусной кислоты и 0,1% (вес./об.) кумасси бриллиантового синего, разбавленного водой. Гели погружают в краску примерно на 1 ч (или до достаточного окрашивания) при осторожном перемешивании (будьте осторожны, чтобы не разорвать гель). Нагревание может ускорить этот процесс, но не кипятите раствор. Затем смойте лишнее пятно; вы заметите, что краситель также окрашивает полиакриламидный гель, хотя и в меньшей степени, чем белки.Поэтому гели должны быть затем обесцвечены. Поскольку краситель более прочно связывается с белками, чем с гелем, краситель можно удалить из частей геля, не содержащих белков, с помощью растворителя, аналогичного растворителю, в котором краситель отсутствует. Типичное обесцвечивание использует 50% (об./об.) метанола в воде с 10% (об./об.) уксусной кислоты. Гели можно оставить на ночь в обесцвечивании при осторожном перемешивании, чтобы получить четкий фон с окрашенными белковыми полосами, но, как и при окрашивании, обесцвечивание можно ускорить нагреванием. Затем гели промывают водой, и их можно сразу визуализировать; их можно хранить в небольшом количестве воды, чтобы предотвратить обезвоживание.


Растворы, окрашивающие белки без необходимости обесцвечивания, доступны и могут быть особенно полезны, если требуется быстрый результат. Однако они, как правило, дороже, чем стандартный протокол окрашивания. Другие красители, такие как окрашивание серебром, 6 , также могут использоваться для определенных целей, но окрашивание кумасси является наиболее распространенным.

Интерпретация белковых гелей

Поскольку гели для ПААГ обычно окрашивают кумасси бриллиантовым синим для обнаружения, их можно визуализировать и исследовать невооруженным глазом, в отличие от агарозных гелей ДНК.Изображения могут быть захвачены камерой, чтобы обеспечить долгосрочную запись. Маркерные лестницы обычно запускаются вместе с образцами белка, чтобы можно было оценить их размер (обычно в кДа) (рис. 4). Важно отметить, какой образец загружается на какую дорожку, чтобы обеспечить точную интерпретацию результатов. В нативных гелях PAGE размеры могут быть неточными из-за вторичных структур, влияющих на их прохождение через гель. В этих случаях могут быть включены эталонные белки, чтобы дать пользователю представление о том, как и где можно ожидать появления их мишени.Нативный PAGE также очень полезен, когда сравниваются образцы на одном и том же геле, например, с различными обработками, условиями или партнерами по связыванию, для поиска различий. Сила полосы может указывать на количество присутствующего белка, чем больше белка, тем сильнее полоса. Если загружено слишком много образца, полосы могут выглядеть как четкие темные пятна, которые трудно или невозможно интерпретировать. В этих случаях следует рассмотреть возможность повторения анализа с меньшим количеством образцов.


Рис. 4: SDS PAGE с ДНК-полимеразой Taq.SDS PAGE — полезный метод для разделения белков в соответствии с их электрофоретической подвижностью. Маркер (левая дорожка) — это стандарт Precision Plus Protein Standard, полностью синий. Этот SDS PAGE проводили для определения молекулярной массы ДНК-полимеразы Taq. Авторы и права: Марта Феррейра, воспроизведено по лицензии Creative Commons Attribution 2.5 Generic , Creative Commons Attribution-Share Alike 3.0 Unported и лицензии GNU Free Documentation 9 8.

Двухмерный гель-электрофорез

Иногда разделения белков в одном измерении недостаточно для выделения сходных видов. В таких случаях разделение в двух измерениях может добавить требуемую разрешающую способность, поскольку маловероятно, что две молекулы будут очень похожи по двум различным свойствам. Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле, или 2D PAGE, был представлен в 1975 году одновременно Йоахимом Клозе 7 и Патриком Х. О’Фаррелом. 8


В первом измерении белки разделяются линейно в соответствии с их изоэлектрической точкой (которая связана с их зарядом и рН). Во втором измерении молекулы затем разделяются под углом 90° к первому разделению в соответствии с молекулярной массой для получения электрофореграммы (рис. 5).


Рис. 5: Пример 2D-СТРАНИЦЫ. Горизонтальное разделение белков (ось X) соответствует изоэлектрической точке, вертикальное разделение (ось Y) соответствует молекулярной массе.Образец получен из растений огурца, заселенных патогенным грибком. Предоставлено Michal Sharo, Itayba, воспроизведено в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution-Share Alike 3.0 Unported и лицензией GNU Free Documentation .

Применение электрофореза белков

ПААГ используется во многих биологических дисциплинах, от молекулярной биологии и криминалистики до биохимии и геномики, обеспечивая важный аналитический и диагностический инструмент.Давайте рассмотрим некоторые методы, в которых PAGE является важным компонентом.

Анализ белков

Исследование образцов непосредственно с помощью электрофореза в электрофорезе может дать ряд полезных индикаторов, в том числе:

  • присутствует ли ожидаемый белок
  • насколько чист образец белка
  • если отщепление (например, от метки) было успешным
  • в какой фракции присутствует белок (например,г., из фракций клеточного лизата)
  • растворимость белка


При получении рекомбинантных белков 9 важно иметь возможность проверить, что интересующий белок не был потерян на нескольких стадиях процесса очистки и что он появляется в ожидаемом размере. В зависимости от фракции, в которой он присутствует, это также может указывать на проблемы с растворимостью белка, которые могут повлиять на его функцию или связывающую способность или препятствовать его очистке в используемых условиях.Посторонние полосы в конце процесса очистки также могут свидетельствовать о наличии загрязнений. Рекомбинантные белки играют ключевую роль в разработке вакцин и биофармацевтических препаратов, а также в диагностических анализах и исследованиях.


Анализ белков также важен для многих дисциплин, включая разработку продуктов питания и напитков, 10 контроль качества, 11 безопасность 12, 13 и обнаружение мошенничества 14 и анализ проб окружающей среды. 15, 16 Однако по мере того, как технологии развиваются и становятся все более доступными, некоторые анализы в этих областях заменяются такими методами, как масс-спектрометрия (МС).

Анализ сдвига электрофоретической подвижности

Анализы сдвига электрофоретической подвижности (EMSA) являются важным экспериментальным инструментом для идентификации комплексов нуклеиновая кислота-белок. Это может помочь идентифицировать сайты связывания, такие как те, которые используются факторами транскрипции. 18 Хотя для этого часто используются агарозные гели, поскольку они облегчают миграцию более крупных комплексов ДНК-белок, электрофорез в электрофорезе может обеспечить большее разрешение при разделении и большую стабильность для некоторых комплексов. 19

Вестерн-блоттинг

Разделение образцов белков является важным первым шагом в любом эксперименте вестерн-блоттинга, и для этого обычно используется метод электрофореза в электрофорезе. В то время как гели PAGE наносятся на мембраны для самого блота, дублированные гели PAGE также могут быть окрашены кумасси бриллиантовым синим, чтобы служить в качестве контроля загрузки, когда дело доходит до интерпретации результатов вестерн-блоттинга. Их можно использовать для диагностики инфекционных и неинфекционных заболеваний, оценки эффективности терапевтических вмешательств, информирования фундаментальных исследований, проверки очистки рекомбинантных белков 20 и предоставления функциональной или достоверной информации для исследований омиков.

Экстракция для масс-спектрометрии

После разделения белки в полосах геля могут быть вырезаны и очищены для дальнейшего анализа. Такие методы, как МС, можно использовать для получения подробной информации о белках в образце.

Электрофорез белков мочи и иммунофиксационный электрофорез

ПААГ может быть полезным диагностическим инструментом для определения количества определенных белков в жидкостях организма, таких как моча или кровь. Электрофорез в агарозном геле и капиллярный электрофорез также могут использоваться в качестве альтернатив для этих анализов.


Обычно белок в моче должен отсутствовать или содержаться очень мало, поэтому тест электрофореза белка мочи (UPEP) , который обычно измеряет альбумин и глобулины, можно использовать в качестве индикатора патологических изменений. Высокий уровень белка в моче может указывать на многочисленные состояния, включая воспаление, заболевание почек, инфекции 21, 22 и некоторые виды рака (например, миелому) 23 , и помогает направлять дальнейшее обследование или лечение.


Альбумин и иммуноглобулины 24 также можно анализировать в образцах сыворотки ( электрофорез белков сыворотки (SPEP) ) для диагностики ряда состояний, включая рак, например, множественную миелому, 25 лимфому и лейкемию, заболевания почек, печени болезни, нарушения питания, а также некоторые неврологические и аутоиммунные состояния.


Иммунофиксация 26 может использоваться в этих тестах для идентификации определенных подтипов белка, например.g., иммуноглобулин A (IgA) лямбда 27 или тип тяжелой и легкой цепи белка M. 28, 29


Каталожные номера


1. Laemmli UK. Расщепление структурных белков при сборке головки бактериофага Т4. Природа . 1970;227(5259):680-685. doi:10.1038/227680a0

2. Arndt C, Koristka S, Bartsch H, Bachmann M. Нативные полиакриламидные гели. В: Куриен Б.Т., Скофилд Р.Х., ред. Электрофорез белков: методы и протоколы . Методы молекулярной биологии. Хумана Пресс; 2012: 49-53. doi:10.1007/978-1-61779-821-4_5

3. Lanzillo JJ, Stevens J, Fanburg BL. Сравнение часто используемых прерывистых и непрерывных буферных систем для электрофореза в полиакриламидных гелях, содержащих додецилсульфат натрия. Электрофор . 1980;1(3-4):180-186. doi:10.1002/elps.1150010312

4. De St. Groth SF, Webster RG, Datyner A. Два новых метода окрашивания для количественной оценки белков на электрофоретических полосках. Биохим Биофиз Акта . 1963; 71:377-391. doi:10.1016/0006-3002(63)91092-8

5. Мейер Т.С., Ламбертс Б.Л. Использование кумасси бриллиантового синего R250 для электрофореза микрограммов белков слюны околоушной железы на полосках акриламидного геля. Биохим Биофиз Acta Gen Subj . 1965;107(1):144-145. doi:10.1016/0304-4165(65)-4

6. Chevallet M, Luche S, Rabilloud T. Окрашивание белков серебром в полиакриламидных гелях. Нац.протокол . 2006;1(4):1852-1858.doi:10.1038/nprot.2006.288

7. Klose J. Картирование белков с помощью комбинированного изоэлектрического фокусирования и электрофореза тканей мыши. Гум Жене . 1975;26(3):231-243. doi:10.1007/BF00281458

8. O’Farrell PH. Двумерный электрофорез белков высокого разрешения. J Биол Хим . 1975;250(10):4007-4021. PMID:236308

9. Wingfield PT. Обзор очистки рекомбинантных белков. Curr Protoc Protein Sci . 2015;80:6.1.1-6.1.35. doi:10.1002/0471140864.ps0601s80

10. Jovanovic S, Barac M, Macej O, Vucic T, Lacnjevac C. SDS-PAGE анализ растворимых белков в восстановленном молоке, подвергшемся различным термическим обработкам. Датчики . 2007;7(3):371-383. doi:10.3390/s7030371

11. Пигин Д.Г. Электрофорез как полезный метод изучения качества мясных продуктов. В: Гоуси К. изд. Электрофорез . ИнтехОткрытый; 2012. doi:10.5772/45761

12. Karina C, Elisa CC, Carola G, et al.Контроль белковых ингредиентов в безглютеновых продуктах с использованием SDS-PAGE, разработанных конкурентных иммуноферментных анализов и коммерческих наборов ELISA. WJFST . 2018;2(1):12. doi:10.11648/j.wjfst.20180201.12

13. Abe T, Naito T, Uemura D. Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) анализ палитоксина. Нац. Произв. коммун. 2017;12(8):1934578X1701200815. doi:10.1177/1934578X1701200815

14. Magenis RB, Prudêncio ES, Molognoni L, Daguer H.Метод контроля для проверки подлинности состава сыра Минас фрескаль с помощью гель-электрофореза. J Agric Food Chem . 2014;62(33):8333-8339. doi:10.1021/jf502864e

15. Мухаммад О.И., Махмуд У.М., Фацио Ф., Сайед АЭДХ. Метод SDS-PAGE как биомаркер для токсикологических исследований рыб. Токсикол. Реп . 2018;5:905-909. doi:10.1016/j.toxrep.2018.08.020

16. Осман К.М., Амин З.М.С., Али М.АК., Хассан Х., Солиман В.С. Профили белков теплового шока SDS-PAGE штаммов Aeromonas из окружающей среды. Pol J Microbiol . 2011;60(2):149-154. PMID: 213

17. Wessels HJCT, Vogel RO, van den Heuvel L, et al. ЖХ-МС/МС как альтернатива SDS-PAGE в синем нативном анализе белковых комплексов. Протеомика . 2009;9(17):4221-4228. doi:10.1002/pmic.2007

18. Юсаф Н., Гулд Д. Демонстрация взаимодействия факторов транскрипции с ДНК с помощью анализа сдвига электрофоретической подвижности. В: Гулд Д., изд. Синтетические промоутеры млекопитающих . Методы молекулярной биологии.Спрингер; 2017: 11-21. doi:10.1007/978-1-4939-7223-4_2

19. Хеллман Л.М., Фрид М.Г. Анализ сдвига электрофоретической подвижности (EMSA) для обнаружения взаимодействий белок-нуклеиновая кислота. Нац.протокол . 2007;2(8):1849-1861. doi:10.1038/nprot.2007.249

20. Rosano GL, Ceccarelli EA. Экспрессия рекомбинантного белка в Escherichia coli : достижения и проблемы. Передний микробиол . 2014;5. doi:10.3389/fmicb.2014.00172

21. Mertens R, Granzen B, Vogt K, Melzer H, Mann H.Анализ белка мочи с помощью гель-электрофореза и лазерной денситометрии после химиотерапии у онкологических больных у детей. Педиатр. Гематол. Онкол. 2000;17(5):365-374. doi:10.1080/08880010050034292

22. Erdoğan Ö, Demircin G, Bülbül M, Memiş L, Öner A. Совместим ли характер экскреции белка с мочой с почечными морфологическими данными при почечном амилоидозе? Рен Фэйл . 2009;31(1):13-17. doi:10.1080/08860220802546305

23. Brandhorst D, Wetter O. Изучение уропротеинов у больных миеломой с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE). Клин Вохеншр . 1980;58(11):585-587. doi:10.1007/BF01477171

24. Vavricka SR, Burri E, Beglinger C, Degen L, Manz M. Электрофорез белков сыворотки: малоиспользуемый, но очень полезный тест. Переваривание . 2009;79(4):203-210. doi:10.1159/000212077

25. О’Коннелл Т., Хорита Т.Дж., Касрави Б. Понимание и интерпретация электрофореза белков сыворотки. АФП . 2005;71(1):105-112.

26. Wiencek JR, Duh SH, Christenson RH. Глава 22 — Белки: анализ и интерпретация в сыворотке, моче и спинномозговой жидкости.В: Кларк В., Марзинке М.А., ред. Современная практика клинической химии (четвертое издание) . Академическая пресса; 2020: 365-390. doi:10.1016/B978-0-12-815499-1.00022-3

27. Spiegelberg HL, Fishkin BG. Полумолекулы IgA миеломы человека. Дж Клин Инвест . 1976;58(5):1259-1265. doi:10.1172/JCI108580

28. Раджкумар С.В. 193 — Заболевания плазматических клеток. В: Goldman L, Schafer AI, ред. Goldman’s Cecil Medicine (двадцать четвертое издание) . В.Б. Сондерс; 2012:1233-1243.doi:10.1016/B978-1-4377-1604-7.00193-7

29. Abraham SR, Barnidge DR, Lanza IR. Оценка белков иммунной системы. В: Изд. Rich RR. Клиническая иммунология: принципы и практика: четвертое издание. Elsevier Ltd: 2013:1145-1159. doi:10.1016/B978-0-7234-3691-1.00106-9

  

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка браузера на прием файлов cookie

Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее распространенные причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.

Что такое электрофорез в полиакриламидном геле (PAGE)?

Методы электрофореза разделяют заряженные молекулы в электрическом поле.Подвижность молекулы обратно пропорциональна ее размеру и прямо пропорциональна заряду. Во время электрофореза белки движутся к противоположно заряженному электроду в электрическом поле.

Скорость их движения в электрофоретической системе определяется несколькими факторами, такими как температура, pH и концентрация буфера, в дополнение к внутренним свойствам, таким как размер, заряд и форма белков.

Электрофоретическое разделение белков строго по их молекулярной массе возможно только в том случае, если заряд всех белковых молекул можно манипулировать до одного знака.В таком случае подвижность белковых молекул будет зависеть исключительно от их размера.

Электрофорез в полиакриламидном геле (PAGE) представляет собой метод, основанный на этой идее и используемый для разделения белков на основе их размера.

Принципы СТРАНИЦЫ

В PAGE анионный детергент, называемый додецилсульфатом натрия (SDS), используется для связывания с белками и придания им отрицательного заряда. Затем белки разделяют электрофоретически в зависимости от их размера с использованием гелевой матрицы из полиакриламида в электрическом поле.

Полиакриламид получают в результате реакции полимеризации акриламида и N,N’-метилен-бис-акриламида (БИС) с использованием катализатора. Степень полимеризации или сшивки можно контролировать, регулируя концентрацию акриламида и BIS.

Чем больше поперечных связей, тем тверже гель. Твердость геля, в свою очередь, модулирует трение, испытываемое макромолекулами, когда они проходят через гель во время PAGE, тем самым влияя на разрешение разделения.

Сыпучие гели (4–8 % акриламида) позволяют молекулам с более высокой молекулярной массой быстрее мигрировать через гель, в то время как твердые гели (12–20 % акриламида) ограничивают миграцию крупных молекул и избирательно позволяют мелким проходить через гель.

Протокол SDS-PAGE

1. Подготовка проб:

Образцы белка денатурируют путем нагревания их с детергентом SDS и меркаптоэтанолом. Первый прочно связывается с белками и придает им высокий отрицательный заряд, в то время как второй освобождает сульфгидрильные группы, образуя таким образом полипептидные цепи, несущие избыточный отрицательный заряд и аналогичное отношение заряда к массе.Это помогает разрешать белки строго в зависимости от их размера во время гель-электрофореза.

2. Подготовка геля:

Электрофоретический гель обычно состоит из нескольких компонентов, включая акриламид, BIS и буфер. Смесь дегазируют для предотвращения образования пузырьков при полимеризации геля. Для начала полимеризации добавляют персульфат аммония, источник свободных радикалов и стабилизатор. BIS также добавляют для образования поперечных связей между молекулами акриламида до тех пор, пока в конечном итоге не образуется гель.

3. Электрофорез:

При подаче электрического тока белки мигрируют через гель к положительному электроду, так как имеют отрицательный заряд. Каждая молекула движется с разной скоростью в зависимости от ее молекулярной массы — маленькие молекулы движутся через гель быстрее, чем большие. Миграция обычно происходит быстрее при более высоких напряжениях. Через несколько часов все молекулы белка разделяются по размеру.

4. Окрашивание и визуализация:

После завершения электрофореза гель можно окрасить с помощью цветных красителей, таких как кумасси бриллиантовый синий или бромид этидия, чтобы разделить белки в виде отчетливых цветных полос на геле.

Несвязанный краситель вымывается из геля. Затем окрашенные гели сушат, чтобы можно было измерить интенсивность окраски белковых полос. Полосы радиоактивных белков можно обнаружить с помощью авторадиографии. Белки также можно определить количественно, поскольку содержание белка прямо пропорционально количеству связанного красителя.

В некоторых гелевых системах вместе с образцом белка вводят следящий краситель, такой как бромфеноловый синий. Видимое расстояние, пройденное красителем на геле, помогает определить требуемую продолжительность электрофореза.Бромфеноловый синий перемещается вместе с молекулами образца, пока в конечном итоге не достигает дна геля. Электрофорез должен быть остановлен в этот момент, чтобы исключить электрофорез белковых молекул из геля в буфер.

Каталожные номера:

  1. http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/sdspage/sdspage.html#PAGE
  2. http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf
  3. https://www.thermofisher.com/ca/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/overview-electrophoresis.html
  4. https://www.udel.edu/biology/fschmieg/411acrylamide.htm

Дополнительная литература

Электрофорез в полиакриламидном геле — OpenWetWare

Эта процедура полезна для разделения небольших фрагментов ДНК, небольших количеств ДНК или приложений, где требуется более высокое разрешение, чем может быть достигнуто при электрофорезе в агарозном геле.Поскольку очень трудно удалить ДНК из полиакриламидного геля, рекомендуется использовать этот протокол только в диагностических целях, а не для разделения по размеру полезных фрагментов.

Материалы

Реагенты

  • Раствор акриламида 29:1
  • Буфер 10X TBE
  • Персульфат аммония
  • ТЕМЕД
  • раствор ДНК
  • СИБР зеленый
  • Бромфеноловый синий

Оборудование

  • Вертикальная камера для электрофореза
  • Стеклянные пластины с прокладками (которые подходят к камере)
  • Держатель литья
  • Пипетки

Процедура

1.Поместите стеклянные пластины в устройство для заливки
2. Смешайте следующие компоненты, чтобы получить 5 мл геля (прокладки 0,75 мм)

  • 500 мкл 10-кратного раствора TBE
  • 35 мкл персульфата аммония (10 % масс./об.)
  • X мл раствора акриламида 29:1 (см. таблицу в разделе «Примечания», чтобы определить желаемую концентрацию акриламида)
  • Y мл воды (для приготовления 5 мл)
  • 2 мкл TEMED

3. Внесите раствор акриламида между литейными пластинами пипеткой на 5 мл.
4. Вставьте расческу в верхнюю часть геля и дайте ему высохнуть в вертикальном положении примерно 30 минут.
5. Объедините следующее для всех образцов ДНК, включая лестницу:

  • 10 мкл раствора ДНК
  • 1 мкл зеленого SYBR (100-кратное разведение в ДМСО)
  • 1 мкл бромфенолового синего

6. Вставьте гель в камеру для электрофореза вместе с буферной заслонкой.

  • Убедитесь, что и гель, и буферная заслонка герметичны.
  • Лунки на геле должны быть обращены внутрь.

7. Добавьте 1X TBE в пространство между гелем и буферной дамбой, пока TBE не заполнит лунки в геле.

  • КВЭ не должен просачиваться в пространство за пределами этой камеры.

8. Добавьте 1X TBE во внешнюю камеру до указанного уровня заполнения.
9. Добавьте смесь ДНК в лунки.
10. Подайте 80 вольт и дайте поработать примерно 60 минут.

Примечания

  • Важно обеспечить правильный уровень заполнения аппарата для электрофореза (см. рисунок справа).
  • Для более толстых гелей (большие лунки) необходимо приготовить больше геля. Необходимое количество геля можно рассчитать объемно.
  • Напряжение, подаваемое на гель, будет варьироваться в зависимости от тюбика с гелем, который вы отливаете. Указанное напряжение составляет 1-8 вольт/см. Сантиметры в данном случае определяют длину геля сверху донизу (то есть направление, в котором будет двигаться ДНК).
  • Для определения конечной концентрации акриламида для вашего применения используйте следующую таблицу.Например: если бы у меня был исходный раствор акриламида 40%, и я хотел бы получить 5 мл геля с конечной концентрацией акриламида 12%, я бы добавил 5 мл * (12%/40%) = 1,5 мл раствора акриламида, чтобы сделать мой гель .
Выбор концентрации акриламида
Концентрация акриламида (%) Оптимальное разрешение ДНК (п.н.)
3,5 1000-2000
5,0 80-500
8.0 60-400
12,0 40-200
15,0 25-150
20,0 6-100

Ссылки

  • Сэмбрук Дж.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.