Gellar лари морозильные: Лари морозильные «Frostor/Gellar»

Содержание

Лари морозильные «Frostor/Gellar»

   Морозильный ларь – это горизонтальное холодильное оборудование, предназначенное для хранения продукции в бытовых и коммерческих условиях. Конструкция ларей гармонично сочетает компактность и вместительность, что позволяет в полной мере использовать всю площадь.

 

Типы крышек

 

  • Гнутое стекло. Изогнутая прозрачная крышка обеспечивает панорамный обзор продукции, демонстрируя товар покупателю в наиболее выгодном свете.
  • Прямое стекло. Раздвижная система створок является оптимальным решением для магазинов, торговых залов самообслуживания или торговли с прилавка.
  • Глухая крышка. Морозильные лари с глухой крышкой идеально подходят для дома, для хранения продуктов в подсобных коммерческих или бытовых помещениях.

Характеристики морозильных ларей

 

Универсальность и высокие показатели энергоэффективности морозильных ларей делают их лучшим решением для использования в торговых сферах любого масштаба. Неизменно продуктивная работа в условиях повышенной влажности и высокой температуры позволяет использовать лари в уличной торговле, например, мороженым. Модели ларей могут отличаться по ряду параметров:

 

  • Объем. Полезный объем ларей составляет от 230 до 650 литров.
  • Габариты. Высота (глубина) ларей-морозильников варьирует в пределах от 82 до 85 см, ширина – от 60 до 65 см, а длина – от 80 до 200 см.
  • Температурный режим. В зависимости от типа оборудования – низкотемпературные лари могут поддерживать температуру от -10 до -25°С соответственно.

Внешняя конструкция холодильных ларей предполагает возможность нанесения брендирования под клиента, что является неоспоримым преимуществом для коммерческой сферы. Большинство моделей оснащается дополнительными функциями: подсветка, терморегуляция и т.д. 

 

Инструкция по эксплуатации для морозильных ларей Frostor и Gellar

Морозильные лари Геллар

Морозильные лари являются отличным вариантом, как для магазина, так и супермаркета. В сравнении с другим холодильным оборудованием он, во – первых, экономичный, во-вторых,  практичный: потребляет немного энергии, занимает небольшое количество места и вмещает в себя до 700 литров продукции. Преимуществ у морозильных ларей масса. К примеру, если Вы являетесь продавцом мороженого, именно лари в выгодном свете покажут Вашу продукцию: стеклянная крышка ларя не запотевает и открывает хороший обзор товара.

    Ларь идеально подходит для хранения, демонстрации и рекламы Вашей продукции. Они используются повсеместно: его можно увидеть, проходя в парке мимо летнего кафе, или, зайдя в крупные супермаркеты. Что интересно, существуют такие модели ларей, которые могут заменить Вам бонеты и морозильные ванны. 

      В нашем интернет-магазине Вы можете подобрать ларь для продажи или хранения продукции в магазине, кафе, супермаркете. Мы рады предложить Вам широкий ассортимент морозильных ларей отечественного производства заводов: Polair(Полаир), Frostor(Фростор), Эко-1 (Снеж), различных цветов и исполнения: прямое стекло, гнутое стекло, глухая крышка. Последний может занять место в складском помещении и хранить продукцию до того момента, пока она не потребуется. В морозильных ларях можно хранить любую продукцию, которая требует низких температур: мороженое, мясо, рыбу, птицу, полуфабрикаты и многое другое.

 

Особенности морозильных ларей Frostor Gellar:

  • Уникальная конструкция системы стекол
  • Высокая герметичность
  • Инновационный дизайн
  • Возможность установки LED подсветки
  • Теплоизоляция – пенополиуретан 65 мм
  • Внутренний корпус – алюминий
  • Испаритель – алюминиевая трубка
  • Увеличенный КПД холодильной системы
  • Более низкий уровень энергопотребления

Маркет Cервис – Торговое оборудование

1. Общие положения

1.1. Настоящие Положение является официальным документом Администрации сайта, на котором оно размещено и определяет порядок обработки и защиты информации о физических лицах, пользующихся услугами интернет-сайта (далее — Сайт) и его сервисов (далее — Пользователи).

1.2. Отношения, связанные со сбором, хранением, распространением и защитой информации о пользователях Сайта, регулируются настоящим Положением, иными официальными документами Администрации Сайта и действующим законодательством Российской Федерации.

1.3. Регистрируясь, отправляя сообщения, заявки, лиды, иные послания с помощью средств и форм связи на Сайте, Пользователь выражает свое согласие с условиями Положения. В случае несогласия Пользователя с условиями Положения использование Сайта и его сервисов должно быть немедленно прекращено. Ответственность за это несет сам Пользователь.

1.4. Администрация Сайта не проверяет достоверность получаемой (собираемой) информации о Пользователях, за исключением случаев, когда такая проверка необходима в целях исполнения Администрацией Сайта обязательств перед Пользователем.

2. Условия и цели обработки персональных данных

2.1. Администрация Сайта осуществляет обработку персональных данных пользователя в целях исполнения своих обязательств между Администрацией Сайта и Пользователем в рамках предоставления информации о деятельности и работе структурных подразделений владельцев Сайта. В силу статьи 6 Федерального закона от 27.07.2006 № 152-ФЗ «О персональных данных» отдельное согласие пользователя на обработку его персональных данных не требуется. В силу п.п. 2 п. 2 статьи 22 указанного закона Администрация Сайта вправе осуществлять обработку персональных данных без уведомления уполномоченного органа по защите прав субъектов персональных данных.

3. Порядок ввода в действие и изменения Положения

3.1. Положение вступает в силу с момента его размещения на Сайте и действует бессрочно, до замены его новым Положением.

3.2. Действующая редакция Положения, являющимся публичным документом, доступна любому пользователю сети Интернет.

3.3. Администрация Сайта вправе вносить изменения в Положение. При внесении изменений в Положение уведомляет об этом пользователей путем размещения новой редакции на Сайте по постоянному адресу. Предыдущие редакции Положения при этом утрачивают силу.

4. Цели обработки информации

4.1. Администрация Сайта осуществляет обработку информации о Пользователях, в том числе их персональных данных, в целях выполнения обязательств между Администрацией Сайта и Пользователем в рамках предоставления информации о деятельности и работе структурных подразделений владельцев Сайта.

5. Состав персональных данных

5.1. Персональные данные предоставляются Пользователем добровольно, означают согласие на их обработку Администрацией Сайта и включают в себя:

5.1.1. предоставляемые Пользователями минимально необходимые данные для связи: имя (возможно использование вымышленного), номер мобильного телефона и/или адрес электронной почты. Иные данные (в том числе пол, возраст, дата рождения и т.д.) предоставляется Пользователем по желанию и в случае необходимости таких данных для связи с пользователем.

5.2. Иная информация о Пользователях, обрабатываемая Администрацией Сайта.

Администрация Сайта обрабатывает также иную информацию о Пользователях, которая включает в себя:

5.2.1. стандартные данные, автоматически получаемые сервером при доступе к Сайту и последующих действиях Пользователя (IP-адрес хоста, вид операционной системы пользователя, страницы Сайта, посещаемые пользователем).

5.2.2. информация, автоматически получаемая при доступе к Сайту с использованием закладок (cookies).

5.2.3. информация, полученная в результате действий Пользователя на Сайте.

5.2.4. информация, полученная в результате действий других пользователей на Сайте.

5.2.5. информация, необходимая для идентификации Пользователя для доступа к сервисам сайта.

6. Обработка информации о пользователях

6.1. Обработка персональных данных осуществляется на основе следующих принципов:

— законности целей и способов обработки персональных данных;

— добросовестности;

— соответствия целей обработки персональных данных целям, заранее определенным и заявленным при сборе персональных данных, а также полномочиям Администрации Сайта;

— соответствия объема и характера обрабатываемых персональных данных, способов обработки персональных данных целям обработки персональных данных;

6.2. Сбор персональных данных.

6.2.1. Сбор персональных данных Пользователя осуществляется на Сайте при при внесении их пользователем по своей инициативе на момент обращения к Администрации сайта либо к сайту, согласно настроек Пользователя.

6.2.2. Имя, адрес электронной почты и\или телефон предоставляются Пользователем для осуществления обратной связи и для стандартной работы на Сайте не требуются.

6.2.3. Остальные Персональные данные, предоставляются Пользователем дополнительно по собственной инициативе с использованием соответствующих разделов и ресурсов Сайта.

6.3. Хранение и использование персональных данных

6.3.1. Персональные данные Пользователей хранятся исключительно на электронных носителях и обрабатываются с использованием автоматизированных систем, за исключением случаев, когда неавтоматизированная обработка персональных данных необходима в связи с исполнением требований законодательства.

6.4. Передача персональных данных

6.4.1. Персональные данные Пользователей не передаются каким-либо лицам, за исключением случаев, прямо предусмотренных настоящим Положением.

6.4.2. Персональные данные, добровольно указанные Пользователем могут быть переданы ответственному сотруднику компании ООО «ТСК Маркет Сервис» (ИНН 6165560566) для исполнения обязательств Администрации Сайта по информированию Пользователей.

6.4.3. Приложения, используемые Пользователями на Сайте, размещаются и поддерживаются третьими лицами (разработчиками), которые действуют независимо от Администрации Сайта и не выступают от имени или по поручению Администрации Сайта. Пользователи обязаны самостоятельно ознакомиться с правилами оказания услуг и политикой защиты персональных данных таких третьих лиц (разработчиков) до начала использования соответствующих приложений.

6.4.4. Предоставление персональных данных Пользователей по запросу государственных органов (органов местного самоуправления) осуществляется в порядке, предусмотренном законодательством.

6.5. Уничтожение персональных данных

6.5.1. Персональные данные пользователя уничтожаются по письменной просьбе Пользователя. Просьба должна содержат идентификационные данные, которые прямо указывает на принадлежность информации данному Пользователю.

7. Меры по защите информации о Пользователях.

7.1. Администрация Сайта принимает технические и организационно-правовые меры в целях обеспечения защиты персональных данных Пользователя от неправомерного или случайного доступа к ним, уничтожения, изменения, блокирования, копирования, распространения, а также от иных неправомерных действий.

8. Ограничение действия Правил.

8.1. Действие настоящих Правил не распространяется на действия и интернет-ресурсов третьих лиц.

8.2. Администрация Сайта не несет ответственности за действия третьих лиц, получивших в результате использования Интернета или Услуг Сайта доступ к информации о Пользователе и за последствия использования информации, которая, в силу природы Сайта, доступна любому пользователю сети Интернет.

8.3. Администрация Сайта рекомендует Пользователям ответственно подходить к решению вопроса об объеме информации о себе, передаваемой с Сайта.

Морозильные лари Frostor / Gellar

Главная Морозильные лари Морозильные лари Frostor / Gellar

  Компания Фростор Групп специализируется на производстве и продаже морозильных ларей. Собственный завод, уникальные разработки компании позволяют создавать продукт, который пользуется спросом и на отечественном, и на зарубежном рынке.

  Будучи одним из лидеров среди производителей холодильного торгового оборудования, FROSTOR предлагает широкий ассортимент ларей под любые виды замороженной и охлажденной продукции. 

 

Холодильное оборудование FROSTOR/GELLAR дает возможность поддерживать оптимальный температурный режим вне зависимости от окружающих условий, что, в свою очередь, помогает без труда сохранять товарный вид продуктов в течение долгого времени.

Качество

Морозильные лари FROSTOR обладают высокой термоизоляцией и постоянным температурным контролем. Установка мощных компрессоров Eateron гарантирует надежную работу при высоких температурах окружающей среды. Высококачественные теплоизоляционные материалы и точно рассчитанный тепловой баланс повышают коэффициент полезного действия и делают торговое оборудование FROSTOR экономичным.

Долговечность

При создании морозильных ларей торговой марки FROSTOR используются только высококачественные материалы. Цельный контур позволяет избежать утечки хладагента, а оцинкованное покрытие испарителя – коррозии металла. Обязательная проверка ОТК каждого морозильного ларя уже после сборки позволяет дать высокую гарантию эксплуатации.

Широкий ассортимент продукции

Модельный ряд включает в себя несколько серий холодильных и морозильных ларей, каждая из которых имеет широкую линейку спецификаций, так что любой заказчик найдет необходимое именно ему торговое оборудование.

Стильный дизайн

Внимание обращается не только на функциональность и качество, но и на внешний вид торгового оборудования. Постоянно совершенствуется дизайн холодильных шкафов и морозильных ларей, учитывая именно пожелания покупателей. Все холодильное оборудование FROSTOR имеет оптимальные соотношения габаритных размеров.

Инновации

Чтобы удовлетворять запросы клиентов и сохранять ведущие позиции на рынке морозильных ларей, постоянно внедряются новые технологические решения и совершенствуется продукция.

Довольные клиенты

Результат работы специалистов «ФРОСТОР ГРУПП» — растущее число довольных покупкой заказчиков. Неизменно высокие оценки продукции — лучшее подтверждение эффективности торгового оборудования FROSTOR.

Морозильный ларь – это горизонтальное холодильное оборудование, предназначенное для хранения продукции в бытовых и коммерческих условиях. Конструкция ларей гармонично сочетает компактность и вместительность, что позволяет в полной мере использовать всю площадь.

Типы крышек

  • Гнутое стекло. Изогнутая прозрачная крышка обеспечивает панорамный обзор продукции, демонстрируя товар покупателю в наиболее выгодном свете.
  • Прямое стекло. Раздвижная система створок является оптимальным решением для магазинов, торговых залов самообслуживания или торговли с прилавка.
  • Глухая крышка. Морозильные лари с глухой крышкой идеально подходят для дома, для хранения продуктов в подсобных коммерческих или бытовых помещениях.

Характеристики морозильных ларей

Универсальность и высокие показатели энергоэффективности морозильных ларей делают их лучшим решением для использования в торговых сферах любого масштаба. Неизменно продуктивная работа в условиях повышенной влажности и высокой температуры позволяет использовать лари в уличной торговле, например, мороженым. Модели ларей могут отличаться по ряду параметров:

  • Объем. Полезный объем ларей составляет от 230 до 650 литров.
  • Габариты. Высота (глубина) ларей-морозильников варьирует в пределах от 82 до 85 см, ширина – от 60 до 65 см, а длина – от 80 до 200 см.
  • Температурный режим. В зависимости от типа оборудования – низкотемпературные лари могут поддерживать температуру от -10 до -25°С соответственно.

Внешняя конструкция холодильных ларей предполагает возможность нанесения брендирования под клиента, что является неоспоримым преимуществом для коммерческой сферы. Большинство моделей оснащается дополнительными функциями: подсветка, терморегуляция и т.д.

Все о гелевой фазе — Soap Queen

Выглядело ли когда-нибудь ваше мыло, полученное холодной обработкой, гелеобразным после нескольких часов пребывания в форме? Скорее всего, он проходит через гелевую фазу. Это часть процесса омыления, когда мыло нагревается до 180 ° F. Это не влияет на качество конечных полос, но влияет на то, как они выглядят.

Вы можете выбрать, следует ли форсировать гелеобразную фазу, в зависимости от вашего рецепта и личных предпочтений.

Форсирование гелевой фазы
Есть несколько причин, по которым вы можете захотеть загустеть мыло:

  • Вам нужны яркие цвета.Гелевая фаза помогает цветам выделяться и придает полосам слегка блестящий вид. Узнайте больше о том, как раскрасить мыло ручной работы здесь.
  • Вы используете натуральные красители. Без гелевой фазы они могут иметь тусклый вид и другой оттенок. Например, гелеобразное мыло, окрашенное порошком корня марены, имеет темно-красный оттенок. Нежеланная версия — приглушенно-лиловый. Смотрите обе версии в этом посте.
  • Вы используете LabColors. Гелевая фаза делает их ярче и обеспечивает их точный цвет.Многослойное мыло с лавандой после гелеобразования меняет цвет от серого до пурпурного.
  • Вы спешите. Из-за более высоких температур гелеобразное мыло быстрее затвердевает и деформируется. Мыло еще нужно отвердеть в течение 4-6 недель.

Высокие температуры являются ключом к форсированию гелевой фазы. Начните с щелока и масел при температуре около 120–130 ° F. Когда мыло окажется в форме, накройте его разделочной доской, а затем полотенцем или одеялом.

Если в помещении для производства мыла прохладнее, можно поставить его на грелку, настроенную на средний уровень.Проверьте его через 30 минут, чтобы убедиться, что он не перегревается — это может вызвать вулканы, тепловые туннели или глицериновые реки. Если становится слишком жарко, выключите грелку и снимите одеяло. Если нет, оставьте еще на 30-60 минут. Затем выключите грелку, но оставьте на ней мыло на ночь. Узнайте больше о том, как изолировать мыло здесь.

Предотвращение гелевой фазы
Вот почему вы можете захотеть предотвратить это:

  • Вы предпочитаете матовое мыло. Негелевые батончики выглядят кремовыми и имеют пастельные тона, которые нравятся некоторым производителям.
  • Вы делаете мыло холодной обработки на молоке. Если он станет слишком горячим, он может обгореть, что приведет к обесцвечиванию и появлению неприятного запаха. То же самое может случиться с альтернативными жидкостями, такими как кофе, вино, чай и т. Д.
  • То же самое и с мылом с добавками, такими как фрукты или мед. Мы рекомендуем поддерживать низкие температуры, чтобы не допустить ожогов.
  • Вы работаете с мыльной глазурью. Если он станет слишком горячим, он может потерять форму.

Это чистое медовое мыло хранят в холоде, чтобы предотвратить ожоги.

Чтобы мыло оставалось прохладным, начните с щелока и масел при температуре около 90–100 ° F. После того, как он окажется в форме, положите его в холодильник или морозильную камеру на 24 часа. Вы также можете положить мыло в прохладное место, например, в гараж или подвал, и пропустить через него вентилятор.

Третий вариант — не накрывать мыло при комнатной температуре. Он может образовывать гель или нет, в зависимости от температуры масла и щелока, а также от того, насколько тепло в помещении. Иногда это может привести к частичной гелеобразной фазе, когда одна часть мыла (обычно середина) немного темнее остальных.Опять же, это влияет только на внешний вид полосок — они по-прежнему будут отлично ощущаться на коже.

Эти полоски загустели только посередине, что привело к разнице в цвете.

Как и все в мыловарении, лучший способ выяснить, что вы предпочитаете, — это поэкспериментировать. Попробуйте все три метода, а затем выберите свой любимый.

Этот пост был обновлен в феврале 2019 года.

НЛО — НАСТОЯЩИЕ… НАСА показало мне космический корабль пришельцев, и я в течение многих лет тайно контактировал с инопланетянами, — говорит Ури Геллер.

Бендер ЛОЖКИ Ури Геллер утверждает, что он в течение многих лет тайно работал с американцами, чтобы связаться с инопланетянами.

Ури, 74 года, говорит, что у него были секретные встречи с немецким ракетным инженером Вернером фон Брауном в НАСА, и ему показали часть разбившегося НЛО.

7

Ури Геллер утверждает, что НАСА показало ему кусок разбитого НЛО. Кредит: Twitter

7

Ури утверждает, что встречался с немецким ракетным инженером Вернером фон Брауном Фото: Twitter

7

Ури сказал, что ученый отвез его в секретное место на территории НАСА Фото: Twitter

7

72-летний мужчина утверждает, что правда об НЛО скрывается от общественности Фото: AFP — Getty

«В течение многих лет мне приходилось отрицать свою истинную миссию и маскировать свою работу», — сказал известный экстрасенс, добавив: «Мало. люди знают правду.Я предполагаю, что все мировые лидеры — Обама, Трамп, Нетаньяху — мы общаемся с инопланетянами ».

Он выступил с речью после того, как Пентагон представил свой долгожданный отчет об НЛО Конгрессу США на прошлой неделе, раскрывая 144 необъяснимые встречи «неопознанного воздушного феномена» (UAP) с военными и не исключающий возможного инопланетного происхождения.

Ури сказал, что «в течение многих лет Пентагон знал, что НЛО реальны.

«Они могут предположить, что это секретные технологии из Китая или России, но поверьте мне, они знают гораздо больше, чем это.«

Выводы были основаны на отчетах секретной оперативной группы UAP между 2004 и 2021 годами. Только один был идентифицирован как спущенный воздушный шар.

Они обнаружили, что наблюдения UAP обычно группировались вокруг американских полигонов и полигонов.

В отчете говорится, что некоторые НЛО можно отнести к иностранным технологиям, разработанным Китаем, Россией или неправительственной организацией, но потребуется дополнительный анализ.

В ответ американские военные создадут настоящий «офис секретных материалов» и дадут рекомендации военным базам.

В письме к военным начальникам министр обороны Кэтлин Хикс заявила: «Все сотрудники министерства будут использовать эти процессы, чтобы гарантировать, что UAPTF или его последующие действия будут иметь отчеты о наблюдениях UAP в течение двух недель после происшествия».

‘Я не поверил своим глазам’

Ури утверждает, что ему показали доказательства инопланетян во время секретных экспериментов в Центре космических полетов Годдарда.

Он сказал: «Проехав с Вернером фон Брауном, мы спустились по трем лестничным пролетам в здание и получили оранжевые куртки, подобные тем, что использовались в антарктических экспедициях (с вышитыми синими значками НАСА).

«Тяжелые, толстые дверцы морозильной камеры были открыты. Я не мог поверить своим глазам, но я всегда знал это с пяти лет».

Ури был вынужден встретиться с немецким ракетным инженером своим другом, американским астронавтом Эдгаром Митчеллом.

«К моему шокирующему удивлению, он показал мне кусок разбившегося НЛО».

7

В своей последней книге Ури утверждает, что инопланетяне наделили его экстрасенсорными способностями, когда ему было три года Фото: Гетти — участник

7

Ури известен тем, что сгибает ложки своим умом Фото: AFP — Гетти

7

Молодой Ури в Годдарде Центр космических полетов

Ури, известный своим изгибом ложки, утверждает, что его шурин сфотографировал встречу в закрытой комнате на шпионскую камеру.

Он добавил: «Нацистская партия была одержима оккультизмом. Они обыскивали земной шар в поисках таинственных сил, которые позволили бы им построить свой 1000-летний Рейх».

Когда немецкий аэрокосмический инженер Вернер фон Браун присоединился к военным и космическим программам США после Второй мировой войны, он быстро стал одним из ведущих ученых, которым приписывают разработку баллистической ракеты.

«Когда я встретил его, Вернер фон Браун достал из сейфа какой-то предмет и подал его мне.Он сказал, что это кусок разбившегося НЛО ».

«Он хотел, чтобы я сказал ему, что я чувствую от материала. Я чувствовал, что он не был земным — он был металлическим, удлиненным и имел оттенок, которого я никогда раньше не видел.

Он сказал, что материал ощущается «как живой», что он «дышит».

«Поверхность была жемчужной, почти трехмерной.»

Принц Филипп однажды захотел услышать с Ури об НЛО и инопланетянах.

Ури сказал, что они болтали на благотворительном мероприятии в Сент-Джеймсском дворце в конце 90-х.

Мне показалось, что оно не земное — оно было металлическим, удлиненным и имело оттенок, которого я никогда раньше не видел. Казалось, что он был живым. Как будто он дышал.

Ури Геллер всемирно известный экстрасенс

Он сказал: «Что меня поразило, так это знания принца Филиппа о внеземной жизни, сознании, Вселенной и за ее пределами. Он сказал, что верит в существование НЛО».

Ури утверждает, что инопланетяне наделили его экстрасенсорными способностями, когда он был маленьким.

В возрасте трех лет он столкнулся с НЛО на Рождество 1949 года недалеко от рабочего квартала в Израиле, где он вырос, согласно новой биографии.

Услышав котят, молодой Ури, как говорят, забрел на участок земли позади своего дома.

Внезапно над ним возник яркий свет и ударил его, очевидно активировав его способности.

Позже в жизни он был подвергнут серии странных секретных экспериментов, направленных на использование в качестве оружия экстрасенсорных способностей, свидетельствуют документы ЦРУ.

Во время этих экспериментов его попросили сесть в закрытой и контролируемой комнате.

В одном из тестов были чертежи.Слово было выбрано случайным образом из словаря.

Исследователи пришли к выводу, что Ури «убедительно и недвусмысленно продемонстрировал свои паранормальные способности восприятия».

НЛО заснят на камеру полицейским вертолетом в Уэльсе, который «движется со скоростью 106 миль в час и виден только в инфракрасном диапазоне», поскольку правительство Великобритании призвало раскрыть факты

Тяговая силовая микроскопия высокого разрешения

Methods Cell Biol. Авторская рукопись; доступно в PMC 2016 4 января.

Опубликован в окончательной редакции как:

PMCID: PMC4699589

NIHMSID: NIHMS748056

Сергей В.Плотников

* Национальный институт сердца, легких и крови, Национальные институты здравоохранения, Бетезда, Мэриленд, США

Бенедикт Сабасс

Институт теоретической физики и BioQuant, Гейдельбергский университет, Гейдельберг, Германия Ul

S. Schwarz

Институт теоретической физики и BioQuant, Гейдельбергский университет, Гейдельберг, Германия

Клэр М. Уотерман

* Национальный институт сердца, легких и крови, Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд, США

* Национальный институт сердца, легких и крови, Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд, США

Институт теоретической физики и BioQuant, Гейдельбергский университет, Гейдельберг, Германия

1 Эти авторы внесли равный вклад.

Окончательная отредактированная версия этой статьи издателем доступна на сайте Methods Cell Biol. См. Другие статьи в PMC, в которых цитируется опубликованная статья.

Abstract

Клеточные силы, генерируемые актомиозиновым цитоскелетом и передаваемые во внеклеточный матрикс (ЕСМ) через дискретные белковые сборки на основе интегрина, то есть фокальные спайки, имеют решающее значение для морфогенеза развития и гомеостаза тканей, а также для прогрессирования заболевания в рак. Однако количественное картирование этих сил было трудным, поскольку не существовало экспериментальной техники для визуализации наноньютонных сил с субмикронным пространственным разрешением.Здесь мы предоставляем подробные протоколы для измерения клеточных сил, действующих на двумерные эластичные подложки, с помощью метода микроскопии тягового усилия (TFM) с высоким разрешением. Мы описываем изготовление полиакриламидных подложек, помеченных несколькими цветами реперных маркеров, функционализацию подложек с белками ЕСМ, настройку эксперимента и процедуры визуализации. Кроме того, мы предоставляем теоретические основы реконструкции тяги и экспериментальные соображения, важные для разработки эксперимента TFM с высоким разрешением.Мы описываем реализацию нового алгоритма обработки изображений реперных маркеров, снятых под поверхностью подложки, что значительно улучшает качество данных. Мы демонстрируем применение алгоритма и объясняем, как выбрать параметр регуляризации для подавления ошибки измерения. Краткое обсуждение различных способов визуализации и анализа результатов служит для иллюстрации возможных применений TFM с высоким разрешением в биомедицинских исследованиях.

ВВЕДЕНИЕ

Силы сокращения клеток, генерируемые актомиозиновым цитоскелетом и передаваемые во внеклеточный матрикс (ЕСМ) через фокальные адгезии на основе интегрина, управляют адгезией, распространением и миграцией клеток.Эти силы позволяют клеткам выполнять жизненно важные физиологические задачи во время морфогенеза эмбриона, заживления ран и иммунного ответа (DuFort, Paszek, & Weaver, 2011). Сила клеточной тяги также имеет решающее значение для патологических процессов, таких как метастазирование рака (Wirtz, Konstantopoulos, & Searson, 2011). Таким образом, возможность измерения силы клеточной тяги имеет решающее значение для лучшего понимания клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе многих основных биологических процессов как на клеточном, так и на тканевом уровнях.

За последние 30 лет были разработаны различные экспериментальные методы для количественного картирования силы тяги в пространственных масштабах от многоклеточных пластин до отдельных молекул. Микроскопия силы тяги (TFM) была впервые предложена Харрисом, Уайлдом и Стопаком (1980), которые показали, что фибробласты образуют складки на эластичной подложке из силиконового каучука, что указывает на механическую активность. Применяя известные силы, Harris et al. смогли откалибровать эту технику и оценить величину тяговых усилий.Однако ограничения этого подхода включают сложность количественной оценки силы из-за нелинейности деформации силиконового каучука и низкого пространственного разрешения (Beningo & Wang, 2002; Kraning-Rush, Carey, Califano, & Reinhart-King, 2012). Дальнейшее развитие этого подхода, который сочетал в себе оптическую визуализацию высокого разрешения и обширные вычислительные процедуры, значительно улучшило разрешение, точность и воспроизводимость измерений силы тяги и превратило TFM в метод, который относительно широко используется во многих биомедицинских исследовательских лабораториях (Aratyn-Schaus & Gardel, 2010; Dembo & Wang, 1999; Gardel et al., 2008; Ли, Леонард, Оливер, Исихара и Джейкобсон, 1994; Нг, Бессер, Данузер и Брюгге, 2012 г.).

В наши дни покрытие клеток на непрерывных, линейно эластичных гидрогелях, помеченных флуоресцентными реперными маркерами, является методом выбора для визуализации и измерения силы тяги, оказываемой прикрепленной клеткой. Когда ячейка прикрепляется к поверхности подложки, она деформирует подложку прямо пропорционально приложенной механической силе. Эти упругие деформации могут быть описаны с высокой точностью количественно с помощью механики сплошной среды.С момента первого внедрения этого метода (Dembo, Oliver, Ishihara, & Jacobson, 1996) были изучены различные эластичные материалы и стратегии маркировки, чтобы повысить точность измерений и расширить количество биологических приложений, в которых можно применять TFM. (Балабан и др., 2001; Бенинго, Дембо, Каверина, Смолл и Ван, 2001; Дембо и Ван, 1999).

Благодаря превосходным оптическим и механическим свойствам полиакриламидные гидрогели (ПААГ) стали наиболее широко используемыми подложками для непрерывных измерений силы тяги.ПААГ оптически прозрачны, что позволяет сочетать TFM с широкопольной или конфокальной флуоресцентной микроскопией в дополнение к измерениям силы тяги анализом динамики цитоскелета или фокальной адгезии (Gardel et al., 2008; Oakes, Beckham, Stricker, & Gardel, 2012). Механические свойства полиакриламида также идеальны для TFM, поскольку гели линейно эластичны в широком диапазоне деформаций, а их эластичность можно регулировать для имитации жесткости большинства биологических тканей (Discher, Janmey, & Wang, 2005; Flanagan, Ju, Марг, Остерфилд и Джанми, 2002).Более того, ковалентное поперечное сшивание PAAG со специфическими белками ECM позволяет контролировать биохимические взаимодействия между клеткой и субстратом, чтобы активировать различные классы рецепторов адгезии и, в конечном итоге, имитировать физиологическое микроокружение для различных типов клеток.

Параллельно с разработкой эластичных материалов, оптимизированных для TFM, были предприняты большие усилия для повышения точности и пространственного разрешения, при котором измеряется индуцированная клетками деформация субстрата (Balaban et al., 2001; Бенинго и др., 2001). Недавно были разработаны субстраты TFM с высокой плотностью флуоресцентных микросфер двух разных цветов (Sabass, Gardel, Waterman, & Schwarz, 2008), позволяющие анализировать распределение и динамику тяговых сил в отдельных фокальных адгезиях (Plotnikov, Pasapera , Sabass, & Waterman, 2012).

Протоколы, описанные в этой главе, ориентированы на настройку и выполнение TFM с высоким разрешением для количественной оценки созданных клетками сил тяги в масштабе отдельных фокальных спаек.Мы обсуждаем основные положения и экспериментальные соображения, важные для разработки эксперимента TFM с высоким разрешением. Этот фон особенно важен для новых пользователей, поскольку TFM с высоким разрешением — это в высшей степени междисциплинарный метод, заимствовавший некоторые из своих ключевых концепций из оптической микроскопии, химии полимеров, физики мягкого вещества и компьютерных наук. Здесь мы нацелены на продвинутую аудиторию и предполагаем наличие высокого уровня знаний в процедурах клеточной биологии (включая культивирование клеток млекопитающих и трансфекцию), визуализации живых клеток на основе световой микроскопии (включая ДВС, эпифлуоресценцию, конфокальную визуализацию с вращающимся диском и цифровую визуализацию). ), обработки изображений и математики (включая дифференциальное исчисление и программирование на компьютерном языке высокого уровня, e.г., MATLAB). Эта глава предназначена для ознакомления таких читателей с конкретными протоколами, которые позволят им выполнять TFM с высоким разрешением.

ОСНОВНОЙ ПРИНЦИП МИКРОСКОПИИ ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ ТЯГОВОЙ СИЛЫ (TFM)

TFM с высоким разрешением — это экспериментальный метод, который использует вычислительный анализ направления и величины упругих деформаций субстрата для восстановления созданных клетками сил тяги с субмикронным пространственным разрешением ( ). Эти деформации обнаруживаются путем фиксации бокового смещения реперных маркеров, то есть флуоресцентных шариков, встроенных в подложку, из-за механического напряжения, приложенного адгезивной клеткой.Экспериментально смещения измеряются путем сравнения изображений флуоресцентных шариков в напряженном геле, то есть, когда клетка воздействует на субстрат, с ненапряженным состоянием после того, как клетка была отделена от субстрата ферментативно или механически. Отслеживание смещения отдельных валиков с последующим численным моделированием поля смещения подложки на основе упругой механики дает подробные двумерные векторные карты сил тяги под адгезивной ячейкой.

Принципиальная схема процедуры выполнения микроскопии тягового усилия высокого разрешения (TFM) на совместимой подложке PAA. (А) Схема эксперимента TFM, изображающая эластичный субстрат, деформированный прилипшей клеткой. (B) Блок-схема TFM с высоким разрешением.

Пространственное разрешение TFM определяется пространственной выборкой поля смещения (Sabass et al., 2008), которая ограничена плотностью реперных маркеров и оптическим разрешением микроскопа. Таким образом, маркировка эластичной подложки реперными маркерами с максимально возможной плотностью важна для измерений с высоким разрешением.Однако необходимость разрешения отдельных шариков под микроскопом для отслеживания их движения ограничивает плотность реперных маркеров и ограничивает пространственное разрешение поля смещения. Это верно только в том случае, если все реперные маркеры наблюдаются одновременно. Хотя это применяется для обычного TFM, недавние исследования показали, что разделение реперных маркеров в области длин волн путем маркировки подложки флуоресцентными шариками двух разных цветов преодолевает это ограничение (), удваивает пространственное разрешение поля смещения и позволяет проводить анализ. тяговых сил в субмикронном масштабе (Плотников и др., 2012; Sabass et al., 2008). Использование нескольких цветов реперных маркеров также повышает точность и надежность измерений тягового усилия за счет уменьшения шума и неровностей при отслеживании борта. Эти улучшения могут быть достигнуты только в том случае, если поля смещения для обоих каналов количественно определены с одинаковой точностью, что требует интегрированного и автоматизированного рабочего процесса экспериментов на клетках и обработки изображений.

Двухцветные флуоресцентные шарики на подложках из полиакриламида (PAA) TFM увеличивают эффективную плотность шариков.Конфокальные изображения самой верхней поверхности геля PAA, содержащего красные и дальние красные флуоресцентные наночастицы, визуализируемые красной (левая панель, также показана красным на цветном наложении) и дальней красной (средняя панель, также показана зеленым на наложении цвета) флуоресценцией изображения. Шкала шкалы = 5 мкм.

ПРИНЦИПЫ РЕКОНСТРУКЦИИ ТЯГИ

Практически все процедуры реконструкции тяги основаны на теории линейной эластостатики (Ландау и Лифшиц, 1959), обеспечивая удобную и понятную математическую основу.Мы используем декартову систему координат, в которой координаты ( x 1 , x 2 ) лежат в плоскости, параллельной расслабленной поверхности гидрогеля TFM. Третья нормальная координата x 3 положительна над гелем. Деформации по координате i обозначены как u i . Изменение u i в пространстве вызывает деформацию, которая является актуальной физической концепцией здесь, потому что только относительные деформации создают упругие восстанавливающие силы.В недеформированных координатах x i тензор деформации имеет вид

εij = 12 (∂uj∂xi + ∂ui∂xj + ∑k = 13∂uk∂xi∂uk∂xj) ≈12 (∂uj∂xi + ∂ui∂xj)

(20,1)

Приближенное равенство в последнем члене необходимо для того, чтобы сделать теорию линейной, поскольку квадратичный член представляет геометрические нелинейности. Это приближение подразумевает, что масштаб длины x A , в котором изменяется смещение, больше, чем масштаб смещений u i .Для TFM x A определяется типичным размером фокальной адгезии и обычно составляет порядка 1 мкм. Следовательно, для TFM с высоким разрешением смещения геля должны удовлетворять требованиям: u i <1 мкм.

Для линейно упругих материалов напряжение σ ij пропорционально ε ij (закон Гука). При дальнейшем допущении эталонного состояния без напряжений и гомогенных, изотропных гелей без памяти,

σij = E1 + s (εij + s1−2sδij∑k = 13εkk),

(20.2)

где E — модуль Юнга, определяющий жесткость материала, измеренный в паскалях (Н / м 2 ). Безразмерная величина s — это коэффициент Пуассона, мера сжимаемости материала. Несжимаемые материалы характеризуются с = 0,5. Другие величины, используемые для описания упругого поведения, такие как модуль сдвига или коэффициенты Ламе, могут быть преобразованы в пару ( E, s ).

Адгезивные клетки прикладывают силы только к поверхности эластичного геля, где x 3 = 0.Поскольку пространственные вариации напряжения σ ij внутри объема геля потребуют сил там, где они не применяются, мы имеем 0 = ∂σ ij / ∂ x j для x 3 <0. На поверхности клетка проявляет силу на единицу площади, «тягу», обозначенную как f k . Тяга уравновешивается поверхностным напряжением, приводящим к деформациям u 1,2 при x 3 = const.≤ 0. В большинстве случаев вертикальные силы незначительны; таким образом, 0 = σ zz ( x 3 = 0). Часто предполагается, что гель бесконечно растянут в плоскости ( x 1 , x 2 ) и простирается от x 3 = 0 до x 3 = −∞, что определяет остальные граничные условия. Из-за линейности задачи решение в общем виде можно записать как

ui (x1, x2, x3) = ∫∑j = 12Gij (x1 − x1 ′, x2 − x2 ′, x3) fj (x1 ′, x2 ′) dx1′dx2 ′,

(20.3)

где функция Грина G ij зависит от свойств геля и от граничных условий, обсужденных ранее. Для упругого полупространства решение хорошо известно (, решение Буссинеска, ) (Ландау и Лифшиц, 1959) и может быть легко использовано для TFM.

ОБЗОР МЕТОДОВ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ТЯГОВЫХ СИЛ

Исторически первым подходом к вычислению тяги на основе измеренного поля смещения было обращение интегрального уравнения.(20.3) в реальном пространстве (Dembo & Wang, 1999). Несмотря на свою гибкость, построение матриц и их инвертирование требует больших вычислительных затрат (Herant & Dembo, 2010; Sabass et al., 2008). Значительного упрощения можно достичь, если известны расположение и протяженность участков склеивания. Реконструкция тяги с точечными силами (Schwarz et al., 2002) позволяет избежать численного интегрирования, предполагая, что сила в уравнении. (20.3) локализован для небольших регионов. Этот подход особенно уместен, если расположение сайтов адгезии задается структурой связанных с поверхностью лигандов.

В качестве альтернативы дифференциальные уравнения можно решить с помощью метода конечных элементов (МКЭ) (Yang, Lin, Chen, & Wang, 2006). Преимущество МКЭ в том, что можно изучать почти произвольную геометрию и нелинейные отклики геля. Однако необходимость дискретизации всего объема внутри геля требует вычислений с использованием метода конечных элементов. Подходы FEM особенно подходят для трехмерных систем и недавно были использованы для реконструкции силы тяги для клеток, инкапсулированных в гидрогели PEG (Legant et al., 2010).

С помощью тракционной цитометрии с преобразованием Фурье (FTTC), уравнение. Уравнение (20.3) решается в пространстве Фурье, где интеграл свертки становится умножением матриц (Butler, Tolić-Nørrelykke, Fabry, & Fredberg, 2002). Этот метод эффективен и надежен и пользуется большой популярностью. Следовательно, наш метод также основан на идее решения соответствующих уравнений в пространстве Фурье (Sabass et al., 2008).

ВЫСОКОЕ РАЗРЕШЕНИЕ И РЕГУЛЯРИЗАЦИЯ

На разрешение TFM сильно влияют ошибки в измерениях смещения, вызванные неоднородностью механики подложки, оптическими аберрациями и отсутствием точности в процедурах отслеживания.Ошибки также могут быть результатом нарушения предположения, лежащего в основе реконструкции. Поскольку все эти источники ошибок более или менее локальны, наиболее сильно затрагиваются компоненты с более высокой пространственной частотой восстановленных поверхностных сил. Поэтому для получения хорошего пространственного разрешения в TFM требуется точно настраиваемый и надежный метод удаления шума. Для этого мы используем регуляризацию Тихонова поля тяги в пространстве Фурье (Sabass et al., 2008). Здесь f i ( x 1 , x 2 ) требуется для минимизации функциональности

∑ {x1x2} (‖ui − ui (f1, f2) ‖2 + λ2‖fi‖2),

(20.4)

где u i — измеренные смещения, а u i ( f 1 , f 2 ) — смещения, возникающие в результате тяги f i . 2-норма записывается как ‖… ‖, а сумма по { x 1 , x 2 } покрывает все позиции в пространственной сетке.

В уравнении. (20.4) разница между измерением и реконструкцией наказывается первым членом.Второй член ограничивает величину восстановленных сил и может рассматриваться как представление априорной информации о неопределенности измерения. Увеличение параметра регуляризации λ приводит к более «плавному» виду тягового поля.

20.1 МАТЕРИАЛЫ

Техника TFM высокого разрешения основана на количественном анализе деформации субстрата в ответ на механическую силу, создаваемую клетками. В зависимости от жесткости подложки и сократимости клеток величина деформации варьируется от десятков нанометров до микрометра.Необходимость фиксировать такие небольшие деформации делает систему визуализации ключевым компонентом установки TFM и предъявляет несколько критических требований к ее оптическим характеристикам. Во-первых, система визуализации должна быть оборудована конфокальным сканером, позволяющим визуализировать флуоресцентные шарики, расположенные в самом верхнем слое эластичной подложки. Это увеличивает отношение сигнала к фону флуоресцентных шариков и, таким образом, значительно повышает точность, с которой их можно отслеживать. Во-вторых, система должна быть оснащена водно-иммерсионным объективом с высокой степенью коррекции и большой числовой апертурой.Это уменьшает артефакты изображения, включая сильную сферическую аберрацию, возникающую в результате изображения через толстый слой PAAG, который имеет показатель преломления, близкий к воде. Использование объектива с высокой числовой апертурой также улучшает чувствительность установки формирования изображения, увеличивает отношение сигнал / шум и, в конечном итоге, приводит к более точному измерению поля смещения. В-третьих, пространственная частота дискретизации, то есть частота пикселей системы формирования изображения, должна соответствовать критерию Найквиста (Pawley, 2006), чтобы обеспечить точное расположение реперных маркеров субразрешения с субпиксельной точностью.Это требование особенно важно, если установка TFM основана на конфокальном микроскопе с вращающимся диском, поскольку для любого заданного объектива частота пикселей такой системы определяется размером пикселя камеры CCD и не может быть отрегулирована. Наконец, поскольку для измерения силы тяги требуется визуализация живых клеток, также требуется инкубатор на столешнице или другое устройство для поддержания клеток в физиологических условиях при получении изображений.

20.1.1 ПРИБОР ДЛЯ ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ TFM

Требуется исследовательский инвертированный эпифлуоресцентный микроскоп исследовательского класса с компьютерным управлением.Для TFM с высоким разрешением критически важно, чтобы система визуализации была полностью интегрированной, позволяющей управлять проходящим и эпифлуоресцентным освещением и настройками получения изображения для нескольких каналов флуоресценции. Для наших экспериментов мы используем систему микроскопа Nikon Eclipse Ti, и сопоставимые системы других крупных производителей будут подходящими. Мы используем программный пакет MetaMorph для управления функциями микроскопа. Однако другие коммерческие (например, Nikon Elements) или свободно доступные (например, Nikon Elements).g., Micro-Manager) следует учитывать пакеты программного обеспечения, если стоимость является важным фактором. Если требуется покадровая съемка TFM, микроскоп необходимо оснастить системой коррекции дрейфа фокуса (например, Nikon Perfect Focus) для поддержания фокуса на границе раздела субстрат-клетка. Очень важно, чтобы микроскоп был оснащен промежуточным модулем изменения увеличения (типа скользящей вставки), чтобы критерий отбора проб Найквиста мог быть удовлетворен с помощью объектива и камеры, рекомендованных в последующем тексте.Чтобы получить изображение положения клеток, микроскоп должен быть оснащен компонентами визуализации дифференциального интерференционного контраста (ДИК). Рекомендуется следующее оборудование:

  1. Водно-иммерсионный объектив с высокой степенью коррекции и большим увеличением. Мы используем объектив Nikon 60 × Plan Apo NA 1.2 WI и призмы DIC. Использование водно-иммерсионного объектива сводит к минимуму оптические аберрации, вызванные визуализацией через толстый слой геля PAA.

  2. Конфокальный сканер с вращающимся диском (Yokogawa, CSU-X1-A3), оснащенный четырехгранным лазерным дихроичным светоделителем (Semrock, Di01-T405 / 488/568 / 647-13 × 15 × 0.5) и набор эмиссионных фильтров (Chroma Technology, зеленый, et525 / 50 м; красный, et605 / 52 м; Semrock, дальний красный, LP02-647RU) в колесе электронного фильтра. Конфокальный сканер с вращающимся диском настоятельно рекомендуется для TFM с высоким разрешением, так как он позволяет визуализировать реперные маркеры, расположенные в самом верхнем слое эластичной подложки, при одновременном подавлении флуоресценции, испускаемой не в фокусе шариков, а также позволяет использовать низкоуровневый датчик. шумовая ПЗС-камера в качестве детектора изображения. Использование конфокального сканера с вращающимся диском также минимизирует фотоповреждение клеток и улучшает временное разрешение TFM.Можно использовать систему лазерного сканирующего микроскопа, хотя эти системы имеют тенденцию вызывать большее фотообесцвечивание флуорофоров в живых клетках, а уровень шума детекторов фотоэлектронных умножителей отрицательно влияет на точную локализацию флуоресцентных реперных точек при подборе субпикселей.

  3. Многоволновый лазерный сумматор, позволяющий управлять длиной волны лазерного излучения и модуляцией интенсивности. Поскольку TFM с высоким разрешением требует визуализации трех флуоресцентных каналов в быстрой последовательности, лазерный комбайнер должен обеспечивать по крайней мере три лазерные линии (два цвета шариков и белок с флуоресцентной меткой, экспрессируемый в клетке).Для наших экспериментов мы используем лазерный комбайнер LMM5 (Spectral Applied Research), оснащенный твердотельными лазерами со следующей длиной волны и мощностью: 488 нм (когерентный, 100 мВт), 560 нм (MPB Communications, 100 мВт) и 655 нм. (CrystaLaser, 100 мВт). Обратите внимание, что существенная экономия на стоимости оборудования может быть достигнута путем замены твердотельных лазеров ионным лазером умеренной мощности (например, серии Coherent Innova).

  4. ПЗС-камера научного уровня с размером пикселя 6,45 мкм (Roper Scientific, Photometrics CoolSNAP HQ2).Использование высококачественной цифровой камеры с низким уровнем шума и маленькими пикселями критически важно для TFM с высоким разрешением. Высокий квантовый выход и низкий уровень шума камеры увеличивают отношение сигнал / шум изображения и улучшают точность отслеживания шариков. Однако необходимость согласования частоты пикселей с критерием Найквиста при использовании объектива 60 × диктует, что размер пикселя камеры не должен превышать 6,5 мкм. Таким образом, камеры EM-CCD, все пиксели которых превышают 10 мкм, не рекомендуются для TFM высокого разрешения.Использование камеры CMOS для научных исследований также не рекомендуется, поскольку эти камеры могут генерировать случайные «горячие пиксели» или периодические шаблоны шума, которые мешают работе программного обеспечения для отслеживания шариков.

  5. Инкубатор Airstream (Nevtek, ASI 400). Многие настольные инкубаторы и корпуса для микроскопов доступны на рынке и могут быть приобретены у основных производителей микроскопов. Однако для большинства наших экспериментов с TFM мы предпочитаем использовать простой и недорогой воздушный инкубатор для поддержания стабильной температуры на незакрытом столике микроскопа.

  6. Автоматизированный столик микроскопа XY с замкнутым контуром и линейными энкодерами (например, Applied Scientific Instrumentation, MS-2000). Использование автоматизированного столика микроскопа не является обязательным, но настоятельно рекомендуется, поскольку оно существенно повышает эффективность сбора данных TFM и позволяет визуализировать клетки и субстрат в нескольких положениях стадии до и после трипсинизации клеток.

20.1.2 ПОЛИАКРИЛАМИДНЫЕ ПОДЛОЖКИ С ДВУМЯ ЦВЕТАМИ ФИДУЦИАЛЬНЫХ МАРКЕРОВ

Поскольку механические свойства PAAG легко настраиваются, эти гели являются наиболее часто используемыми подложками для измерения силы тяги.Изменяя концентрацию акриламида и N, N ‘-метиленбисакриламида, строительных блоков ПААГ, можно регулировать жесткость ПААГ, чтобы имитировать жесткость большинства биологических тканей (от 100 Па до 100 кПа) без потери эластичных свойств гель (Yeung et al., 2005). Для большинства наших экспериментов мы используем ПААГ с жесткостью от 4 до 50 кПа; Гели мягче, чем 4 кПа, как правило, препятствуют распространению клеток, в то время как гели жестче, чем 50 кПа, обычно не могут быть деформированы большинством типов клеток.Различные композиции акриламида / бисакриламида можно использовать для получения ПААГ с аналогичной жесткостью. Формулировки, описанные в этой главе, были адаптированы из Yeung et al. (2005), а их модули сдвига были подтверждены группой Gardel (Aratyn-Schaus, Oakes, Stricker, Winter, & Gardel, 2010). Описанные здесь объемы позволят создать гель толщиной ≈30 мкм на покровных стеклах размером 22 × 40 мм. Поскольку степень набухания полимера зависит от состава ПААГ (Kraning-Rush et al., 2012) и не может быть легко предсказан на основе одного только модуля сдвига, важно измерить высоту полученного субстрата TFM. Гель должен быть достаточно густым, чтобы гель мог свободно деформироваться под действием клеточных сил без влияния нижележащего стекла (Sen, Engler, & Discher, 2009). В протоколе, приведенном ниже, мы описываем метод приготовления четырех эластичных ПААГ, связанных покровным стеклом, которые помечены флуоресцентными наночастицами двух разных цветов, которые служат для удвоения пространственного разрешения измерений силы тяги.

20.1.2.1 Предлагаемое оборудование и материалы
  • Вытяжной шкаф.

  • Вращатель для покровных стекол. Это специально разработанное устройство, предназначенное для удаления большей части воды с поверхности геля, прикрепленного к покровному стеклу. Подробное описание прядильщика покровного стекла было опубликовано (Inoué & Spring, 1997) и доступно в Интернете (http://www.proweb.org/kinesin/Methods/SpinnerBox.html).

  • Вакуумная камера.

  • Ванна для ультразвуковой очистки (напр.г., Fisher Scientific FS140). Для приготовления покровных стекол «безупречно чистые» требуется ультразвуковая ванна.

  • покровные стекла (# 1.5, 22 × 40 мм). Мы используем боросиликатные покровные стекла, поставляемые Corning Inc. (№ 2940-224) из-за их чистоты, надежных оптических свойств и низкого теплового расширения. Настоятельно рекомендуется не покупать покровные стекла низкого качества, так как они могут варьироваться в зависимости от химического состава поверхности и оптических свойств.

  • (3-аминопропил) триметоксисилан (APTMS, e.г., Sigma-Aldrich, # 281778)

  • 25% раствор глутаральдегида. Мы используем глутаральдегид класса EM, не содержащий полимеров, упакованный в стеклянные ампулы объемом 10 мл (Электронная микроскопия, №16200).

  • 40% раствор акриламида (например, Bio-Rad, № 161-0140).

  • 2% раствор бисакриламида (например, Bio-Rad, № 161-0142).

  • Персульфат аммония (APS) (например, Sigma-Aldrich, № A3678).

  • N, N, N ‘, N ‘ -тетраметилэтилендиамин (например,г., ТЕМЕД, Био-Рад, # 161-0800).

  • Флуоресцентно меченые латексные микросферы двух цветов. Мы используем красно-оранжевые (565/580 нм, # F8794) и темно-красные (660/680 нм, # F8789) флуоресцентные микросферы (FluoSpheres, модифицированные карбоксилатом микросферы, 0,04 мкм), поставляемые Life Technologies из-за их яркости и устойчивости. к фотоповреждению.

  • Предметные стекла микроскопа. Мы используем предварительно очищенные микропрепараты размером 3 × 1 дюйм Gold Seal, поскольку их превосходная чистота способствует стабильным результатам.

  • Rain-X (глобальные бренды ITW, доступны у поставщиков автомобильных запчастей).

  • Вода, пригодная для молекулярной биологии (ddH 2 O).

20.1.2.2 Протокол
  1. Приготовьте «до скрипа» покровные стекла: для надежных измерений силы тяги требуется строгая очистка покровных стекол, которая обеспечивает плотное прикрепление ПААГ к поверхности стекла. Для наших экспериментов мы используем покровные стекла «безупречной чистоты», приготовленные, как описано в Waterman-Storer (2001).Вкратце, обработайте ультразвуком покровные стекла в течение 30 минут в горячей воде, содержащей моющее средство VersaClean. Промойте покровные стекла несколько раз, а затем обработайте ультразвуком в течение 30 минут в каждом из следующих растворов в следующем порядке: водопроводная вода, дистиллированная вода, 1 мМ ЭДТА, 70% этанол и 100% этанол. Перенесите покровные стекла в банку с завинчивающейся крышкой емкостью 500 мл, залейте их 100% этанолом и храните при комнатной температуре до использования.

  2. Приготовьте мастер-смесь акриламида / бисакриламида: смешайте 40% акриламидный и 2% бисакриламидный исходные растворы следующим образом.У нас есть несколько стандартных решений, оптимизированных для ПААГ разной жесткости. Исходные растворы можно хранить не менее года при температуре 4 ° C.

    Таблица 20.1

    Состав акриламидного / бисакриламидного исходного материала и рабочих растворов, необходимых для приготовления подложек для полиакриламидной микроскопии силы тяги (TFM) с жесткостью 2,3–55 кПа

    % 900pare 900 Раствор (3-аминопропил) триметоксисилана (APTMS): перенесите 2 мл APTMS в коническую пробирку на 15 мл, содержащую 2 мл ddH 2 O, и перемешайте пипеткой вверх и вниз. Имейте в виду, что растворение APTMS в воде экзотермично и выделяет много тепла — раствор может начать кипеть.Для обеспечения надежного связывания ПААГ с поверхностью стекла рекомендуется приготовить свежий раствор APTMS в день активации покровного стекла.

  3. Приготовьте 0,5% раствор глутаральдегида: добавьте 1 мл 25% исходного раствора глутаральдегида в 49 мл ddH 2 O.

  4. Приготовьте 10% раствор APS: растворите 10 мг APS в 100 мкл ddH 2 O встряхиванием. В день эксперимента приготовьте свежий раствор APS. В качестве альтернативы раствор APS можно хранить при температуре –20 ° C до месяца.

  5. Активируйте покровные стекла. Поместите четыре «до скрипа» покровных стекла (№ 1,5, 22 × 40 мм) в 15-сантиметровую стеклянную чашку Петри и нанесите 0,5 мл 50% APTMS поверх каждого покровного стекла. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут, добавьте ddH 2 O в чашку Петри, чтобы погрузить покровные стекла (≈30 мл ddH 2 O), и инкубируйте на орбитальном шейкере еще 30 минут. Промойте покровные стекла несколько раз ddH 2 O, перенесите в чашку Петри с 50 мл 0,5% глутарового альдегида и инкубируйте 30 мин при перемешивании.Промойте активированные покровные стекла с помощью ddH 2 O несколько раз, разложите их на подставке для покровных стекол и высушите в эксикаторе. Активированные покровные стекла можно хранить в вакуум-эксикаторе не менее 2 недель. Обратите внимание, что только верхняя поверхность каждого покровного стекла активируется и способна ковалентно связывать PAAG. Убедитесь, что вы следите за верхней поверхностью.

  6. Подготовьте предметные стекла с гидрофобной поверхностью: используйте чистую салфетку KimWipe, чтобы покрыть одно предметное стекло для каждого активированного покровного стекла размером 22 × 40 мм с помощью Rain-X (ITW Global Brands).Дайте предметным стеклам высохнуть в течение 5–10 минут, удалите излишки Rain-X салфеткой KimWipe, тщательно промойте деионизированной водой, а затем несколько раз промойте этанолом. Обязательно удалите со слайдов весь мусор, так как любые оставшиеся частицы будут перенесены на полиакриламидный гель, мешая полимеризации и визуализации. Обычно мы готовим предметные стекла с гидрофобной поверхностью оптом и храним их в вакуум-эксикаторе в течение нескольких месяцев.

  7. Подготовьте полиакриламидный гель для визуализации TFM: приготовьте рабочий раствор акриламида / бисакриламида, смешав требуемый объем исходного раствора, воды и флуоресцентных микросфер двух цветов, как указано в.Чтобы избежать агломерации гранул, обработайте суспензию флуоресцентных микросфер ультразвуком в ультразвуковой ванне в течение 30 с перед добавлением гранул в рабочий раствор. Рабочий раствор дегазируют в вакуумной камере в течение 30 мин для удаления кислорода, который препятствует равномерной полимеризации акриламида. Удалите рабочий раствор из вакуумной камеры; добавить 0,75 мкл TEMED и 2,5 мкл 10% APS для инициации полимеризации. Перемешайте раствор, пипетируя его вверх и вниз несколько раз. Избегайте попадания пузырьков воздуха. Не перемешивайте.Нанесите 17 мкл рабочего раствора акриламида / бисакриламида на гидрофобное предметное стекло микроскопа и накройте активированным покровным стеклом. Убедитесь, что активированная поверхность обращена вниз (в сторону раствора). Дать гелю полимеризоваться 20–30 мин. После полимеризации поднимите угол покровного стекла с помощью лезвия бритвы, чтобы отделить гель от гидрофобного предметного стекла микроскопа, и погрузите гель, прикрепленный к покровному стеклу, в ddH 2 O. Гидратированный PAAG можно хранить в ddH 2 O при температуре 4 ° C на срок до 2 недель.

  8. 20.1.3 ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ ПОЛИАКРИЛАМИДНЫХ СУБСТРАТОВ С БЕЛКАМИ ЕСМ

    Поскольку клетки млекопитающих не прикрепляются к полиакриламиду, белки ЕСМ должны быть ковалентно сшиты с поверхностью субстратов TFM. Мы обычно функционализируем гели фибронектином плазмы человека, хотя также можно использовать другие белки ЕСМ, такие как коллаген I, коллаген IV, ламинин или витронектин. В протоколе в следующем тексте мы описываем метод химической конъюгации фибронектина с поверхностью PAAG с использованием фотоактивируемого гетеробифункционального сшивающего агента Sulfo-SANPAH.

    20.1.3.1 Предлагаемое оборудование и материалы
    • Орбитальный шейкер (например, Thermo Scientific Lab Rotator).

    • Вращатель покровного стекла (см. Предыдущий текст).

    • Ультрафиолетовый сшивающий агент (например, UVP CL-1000), оснащенный длинноволновыми (365 нм) трубками. Рекомендуется использовать сшивающий агент со встроенным УФ-датчиком для обеспечения последовательного сшивания фибронектина с поверхностью ПААГ.

    • N -сульфосукцинимидил-6- (4′-азидо-2′-нитрофениламино) гексаноат (Sulfo-SANPAH, Thermo Fisher Scientific, # 22589).Хотя заказ Sulfo-SANPAH оптом может показаться эффективным, мы рекомендуем покупать флаконы по 50 мг этого химического вещества, чтобы предотвратить его разложение из-за гидролиза.

    • Диметилсульфоксид (ДМСО, например, Sigma-Aldrich, № 41647).

    • Нативный фибронектин, очищенный из плазмы человека (EMD Millipore, 1 мг / мл фибронектина, растворенного в фосфатно-солевом буфере, № 341635). Обратите внимание, что фибронектин, растворенный в трис-буферном физиологическом растворе, необходимо подвергнуть диализу перед сшивкой с субстратом TFM, поскольку аминогруппы Триса будут реагировать со сшивающим агентом.

    • фосфатно-солевой буфер Дульбекко без кальция и магния (DPBS, например, Life Technologies, № 14190-144).

    20.1.3.2 Протокол
    1. Приготовьте раствор Sulfo-SANPAH: Обратите внимание, что Sulfo-SANPAH подвергается быстрому гидролизу при растворении в воде. Приготовьте основной раствор Sulfo-SANPAH, растворив 50 мг порошка Sulfo-SANPAH в 2 мл безводного ДМСО, аликвоты в пробирках Эппендорфа (40 мкл на пробирку) и заморозьте, погрузив пробирки в жидкий азот.Такие исходные растворы Sulfo-SANPAH мы храним при температуре −80 ° C в течение нескольких месяцев.

    2. Возьмите аликвоту (40 мкл) исходного раствора Sulfo-SANPAH из морозильной камеры -80 ° C и разморозьте при комнатной температуре в течение нескольких минут. Одной аликвоты Sulfo-SANPAH достаточно для функционализации двух полиакриламидных гелей 22 × 40 мм.

    3. Приклейте кусок Parafilm в квадратную чашку Петри (10 × 10 см) и нанесите пипеткой по одной 50 мкл раствора фибронектина (1 мг / мл) на Parafilm для каждого покровного стекла.

    4. При размораживании Sulfo-SANPAH быстро вращайте два PAAG, чтобы удалить излишки воды. Если вращатель покровного стекла недоступен, используйте салфетки KIMTECH (Kimberly-Clark) для удаления излишков воды. Будьте осторожны, не касайтесь поверхности геля в центре покровного стекла. Следите за тем, чтобы гели не сохли. Добавьте 0,96 мл ddH 2 O к аликвоте Sulfo-SANPAH, перемешайте пипеткой и нанесите 0,5 мл на верхнюю часть каждого PAAG. Активируйте Sulfo-SANPAH, подвергая гели воздействию длинноволнового УФ-света (365 нм). Чтобы избежать снижения активации Sulfo-SANPAH из-за снижения эффективности УФ-лампы, мы сохраняем постоянную энергию экспонирования (750 мДж / см 2 ), в то время как время воздействия может изменяться.Во время активации цвет раствора Sulfo-SANPAH изменится с оранжевого на коричневый.

    5. Быстро промойте ПААГ с ddH 2 O, высушите центрифугированием, переверните и поместите поверхность геля на каплю раствора фибронектина. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 4 ч, а затем промойте гели несколько раз DPBS при встряхивании на шейкере. Подложки из полиакриламида, покрытые белком ЕСМ, могут храниться при 4 ° C до недели.

    20.2 МЕТОДЫ

    20.2.1 КУЛЬТУРА КЛЕТОК И ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ ДЛЯ ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ TFM

    Для подготовки клеток млекопитающих к TFM требуется базовое оборудование для стерильной культуры ткани. Для целей этой главы предполагается, что читатель знаком с методами культивирования стерильных тканей и имеет доступ к комнате для культивирования тканей. При выборе клеточных линий следует отметить, что вычислительный алгоритм реконструкции силы тяги, обсуждаемый в этой главе, основан на предположении, что деформация эластичного субстрата в анализируемой области вызывается одной клеткой и, таким образом, должна применяться только к типам клеток, которые могут поддерживаться в условиях разреженного культивирования.Множество различных клеточных линий, включая иммортализованные фибробласты эмбрионов мыши (MEF), фибробласты крайней плоти человека, клетки остеосаркомы U2OS и эпителиальные клетки опухоли молочной железы MDA-MB-231, удовлетворяют этому требованию и ранее использовались нами и другими для TFM (Aratyn- Schaus & Gardel, 2010; Gardel et al., 2008; Kraning-Rush et al., 2012; Ng et al., 2012; Плотников и др., 2012; Sabass et al., 2008). Кроме того, для визуализации расположения очаговых адгезий клетки должны быть трансфицированы конструкцией экспрессии кДНК, которая кодирует слияние GFP с общим белком очаговой адгезии.

    20.2.1.1 Предлагаемое оборудование и материалы
    • Реагенты и оборудование для трансфекции. Мы проводим электропорацию с помощью системы Lonza Nucleofector 2b и Nucleofector Kit V (# AAB-1001 и # VCA-1003 соответственно). Однако также можно использовать реагенты для трансфекции на основе липидов, такие как липофектамин или FuGENE.

    • конструкции экспрессии кДНК для визуализации очаговых адгезий в живых клетках. Для большинства экспериментов мы используем C-концевое слияние eGFP с паксиллином, поскольку эта конструкция маркирует фокальные адгезии на всех стадиях созревания (возникающая адгезия, фокальные комплексы и фокальные адгезии) и не оказывает значительного влияния на динамику фокальной адгезии (Webb et al. al., 2004). КДНК должна быть очищена и не должна содержать эндотоксинов.

    • Ячейки. Мы используем увековеченные MEF (ATCC # CRL-1658).

    20.2.1.2 Протокол
    1. Культура желаемой клеточной линии в соответствующей среде и условиях окружающей среды. Например, мы культивируем MEF в среде DMEM с добавлением 15% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ l-глутамина, 100 Ед / мл пенициллина / стрептомицина и заменимых аминокислот во влажной атмосфере, состоящей из 95% воздуха и 5% CO 2 при 37 ° С.

    2. Подготовьте среду для визуализации живых клеток, добавив фетальную бычью сыворотку (конечная концентрация 15%) и l-глутамин (конечная концентрация 2 мМ) в среду DMEM, не содержащую фенолового красного.

    3. За день до измерения силы тяги трансфицировать клетки конструкцией экспрессии кДНК для визуализации очаговых адгезий в живых клетках.

    4. На следующий день после трансфекции клеток предварительно инкубируйте полиакриламидные субстраты в течение 30 минут со средой для визуализации живых клеток, чтобы уравновесить концентрацию ионов / питательных веществ.Собирают трансфицированные MEF с помощью трипсинизации, ресуспендируют в среде для визуализации живых клеток и помещают на субстраты TFM в течение 1–3 часов. Время посева может существенно различаться для разных типов клеток: эпителиальные клетки обычно прикрепляются и распространяются медленнее, чем фибробласты. Для большинства экспериментов мы покрываем клетки ровно настолько, чтобы они полностью распространились и поляризовались. Это уменьшает отложение ECM и ремоделирование матрикса клетками и улучшает воспроизводимость измерений TFM.

    20.2.2 НАСТРОЙКА КАМЕРЫ ПЕРФУЗИИ ДЛЯ TFM И ПОЛУЧЕНИЕ ИЗОБРАЖЕНИЙ TFM

    В экспериментах с TFM изображения получают до и после отделения клетки от субстрата TFM путем перфузии трипсина, чтобы позволить визуализировать напряженный и ненапряженный субстрат. Это требует очень стабильной и надежной системы перфузии, которая позволяет получать изображения с большим увеличением и высоким разрешением с погруженной линзой объектива, жидкую перфузию клеток при поддержании температуры и повторное отображение одного и того же положения без потери фокуса или изменения положения предметного столика.

    20.2.2.1 Предлагаемое оборудование и материалы
    • Перфузионная камера для визуализации живых клеток с соответствующим адаптером столика микроскопа. Для TFM высокого разрешения требуется использование коммерческой перфузионной камеры микроскопа, так как это резко снижает дрейф образца и повышает надежность отслеживания шариков. Мы предлагаем использовать систему закрытых камер RC30 от Warner Instruments, поскольку эта перфузионная камера была специально разработана для линз объектива, погруженных в масло или воду в приложениях конфокальной визуализации, и имеет возможность использовать покровные стекла стандартного размера, обеспечивая получение высококачественных изображений. как в эпифлуоресцентном, так и в проходящем режиме.Большая область обзора этой камеры также увеличивает эффективность сбора данных TFM, так как в одном эксперименте могут быть отображены несколько различных ячеек. Warner Instruments предлагает адаптеры для столиков основных производителей микроскопов, хотя при использовании автоматизированного столика могут потребоваться адаптеры, изготовленные на заказ. Мы используем автоматизированный столик производства Applied Scientific Instruments.

    • покровные стекла (# 1.5, 22 × 30 мм, Corning, # 2940-224).

    • Одноразовые шприцы с люэровским замком объемом 12 мл и трехходовой одноразовый кран с люэровским замком (можно приобрести у поставщиков медицинских товаров).

    • Среда для визуализации живых клеток, приготовленная, как описано в предыдущем разделе.

    • Трипсин – ЭДТА, без фенолового красного (0,5%, Life Technologies, № 15400-054).

    • Вакуумная смазка.

    20.2.2.2 Протокол
    1. Перед экспериментом нагрейте 10 мл аликвоты трипсина-ЭДТА и среды для визуализации живых клеток и загрузите их в одноразовые шприцы на 12 мл.

    2. Соберите перфузионную камеру в соответствии с руководством производителя (http: // www.warneronline.com/Documents/uploader/RC-30%20%20(2001.03.01).pdf). Подключите шприцы с трипсином-ЭДТА и средой к входной линии перфузионной камеры через трехходовой кран и заполните изгиб средой. Убедитесь, что из камеры удалены все пузырьки воздуха. После заполнения камеры используйте ddH 2 O и этанол для очистки верхнего и нижнего покровных стекол камеры. Убедитесь, что камера водонепроницаема, а затем установите ее на микроскоп, убедившись, что она плотно сидит на предметном столике.Погрузите объектив 60 × в воду и отцентрируйте образец над линзой.

    3. Сфокусируйте линзу 60x на клетки, прикрепленные к верхней поверхности PAAG в режиме проходящего света, а затем найдите клетку-кандидат, экспрессирующую умеренные уровни маркера фокальной адгезии с GFP-меткой для TFM, с помощью эпифлуоресцентной визуализации. Используйте визуализацию в проходящем свете, чтобы убедиться, что кандидатная клетка изолирована от других нетрансфицированных клеток в пределах 10–20 мкм от края клетки. Поскольку расстояние распространения силы через подложку линейно масштабируется по мере уменьшения жесткости подложки, следует проявлять дополнительную осторожность при выполнении TFM на подложках мягче, чем 4 кПа.

    4. Вставьте модуль промежуточного увеличения (1,5 ×) в оптический путь микроскопа, чтобы увеличить частоту пространственной дискретизации системы визуализации. Когда включено увеличение 1,5 ×, цифровые изображения, полученные с помощью микроскопа Nikon Ti, оснащенного водно-погруженным объективом 60 × NA 1,2 и CCD-камерой CoolSNAP HQ2, будут удовлетворять критерию Найквиста и подходят для определения положения фидуциарных маркеров с субпиксельной точностью. .

    5. Вставьте компоненты DIC в световой путь и получите изображение ячейки в режиме DIC для справки.Это изображение не требуется для TFM, но его можно использовать позже для количественной оценки площади ячейки.

    6. Удалите призму ДИК со стороны линзы объектива на оптическом пути, чтобы улучшить изображения флуоресцентных микросфер и увеличить пространственное разрешение поля смещения подложки.

    7. Сфокусируйте микроскоп на фокальные спайки эпифлуоресцентным режимом. В случае маркера фокальной адгезии, меченного GFP, фокальные адгезии можно наблюдать в зеленом канале флуоресценции.

    8. Переключитесь в режим конфокальной визуализации с использованием лазерного излучения и вращающегося диска и получайте изображения в каналах GFP и гранул (красный и дальний красный). Отрегулируйте настройки интенсивности освещения и времени экспозиции камеры, чтобы получить изображения во всех трех каналах с одинаковой максимальной интенсивностью флуоресценции, примерно в 5 раз превышающей фоновую область, не содержащую клеток. Для этого может потребоваться несколько изображений и проверка нескольких настроек в каждом канале, чтобы настройки были правильными. Во время этой процедуры минимизируйте воздействие света на образец, так как это приведет к обесцвечиванию и фотоповреждению.Убедитесь, что образец находится в точной фокусировке (используя канал адгезии GFP), потому что даже очень незначительные изменения фокуса с линзой с высокой числовой апертурой сильно повлияют на интенсивность изображения.

    9. Получите покадровые видеоролики TFM путем захвата триплетов изображений флуоресцентно меченных фокальных адгезий и красных и дальних красных флуоресцентных микросфер. Важно получить изображения флуоресцентных шариков разных цветов сразу после друг друга, поскольку деформация подложки быстро изменяется из-за смены фокальной адгезии.Если у вас есть автоматический контроль фокуса, вы можете визуализировать фокальные адгезии в их точной фокальной плоскости и сфотографировать шарики на 0,4–1 мкм глубже в подложку, что даст более контрастные изображения шариков. Кроме того, он позволяет отслеживать шарики без нарушения аутофлуоресценции клеток на поверхности геля. Тем не менее, вертикальное положение x 3 плоскости изображения необходимо тогда учитывать для реконструкции тракции, как описано в последующем тексте.Если система визуализации оснащена автоматическим столиком микроскопа, запомните координаты X и Y и повторите измерения для нескольких клеток. Для покадровой TFM мы получаем триплеты изображений с интервалами ~ 15–60 с.

    10. Удаление клеток с субстрата TFM: после визуализации клеток и напряженного субстрата перфузируйте клетки 5 мл 0,5% раствора трипсина-ЭДТА и инкубируйте его на предметном столике микроскопа в течение 10 минут, чтобы отделить клетки и дать возможность субстрат, чтобы расслабиться из вызванного клетками напряженного состояния.После инкубации удалите отслоившиеся клетки, перфузируя камеру дополнительными 3-5 мл трипсина-ЭДТА.

    11. Гранулы изображения в ненапряженной подложке TFM: сфокусируйтесь на самом верхнем слое геля PAA и получите z -стопок изображений гранул в ненапряженном состоянии с шагом 100 нм. Позже одна из этих плоскостей изображения будет автоматически и беспристрастно выбрана в качестве эталонного (ненапряженного) изображения для количественной оценки деформации подложки.

    12. Переместите столик в каждую запомненную позицию, сфокусируйтесь на самом верхнем слое геля PAA и получите z -стопок изображений шариков в ненапряженном состоянии, как описано.

    20.2.3 КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДЕФОРМАЦИИ УПРУГОЙ ПОДЛОЖКИ

    Отображение нескольких цветов флуоресцентных реперных точек значительно повышает точность и надежность измерения силы тяги, поскольку (1) это увеличивает плотность реперных маркеров, что приводит к лучшей выборке деформации подложки, и (2) это уменьшает шум и неровности в трекинге валика за счет усреднения полей смещения для независимых каналов. В протоколе в предыдущем тексте мы предоставляем пошаговое описание алгоритма, который выбирает эталонные (ненапряженные) изображения для каждого кадра последовательности изображений TFM, идентифицирует флуоресцентные шарики в эталонных изображениях и отслеживает смещение отдельных бусинки с субпиксельной точностью.Хотя начальная обработка изображения, например фильтрация, выравнивание и вычитание изображения, может выполняться с помощью разнообразного программного обеспечения (например, ImageJ и MetaMorph), последующие шаги требуют использования среды программирования высокого уровня, например MATLAB:

    1. Найдите эталонные изображения в стопке z изображений ненапряженного геля. Дрейф предметного столика микроскопа делает необходимым найти наиболее подходящий эталон для каждого изображения последовательности TFM и зарегистрировать изображение и эталон.Это можно сделать автоматически, вычислив коэффициент корреляции между изображениями из деформированного и смещенного эталонного состояния. Коэффициенты корреляции для целых изображений можно эффективно вычислить, используя быстрое преобразование Фурье (БПФ). MATLAB предлагает для этой цели функцию «fft2 ()».

    2. Удалите расфокусированную флуоресценцию и сгладьте каждое эталонное изображение путем вычитания изображения с медианной фильтрацией из оригинала как Iref ‘= Iref-medfilt (Iref).Наилучшие результаты обычно достигаются при размере окна фильтра более 2 мкм 2 . Затем настройте яркость нового изображения как Iref ″ = Iref′ − min (Iref ′).

    3. Найдите локальные максимумы в эталонных изображениях, располагая пиксели, которые ярче, чем их соседи, а также ярче в t раз, чем средняя интенсивность всего изображения. При нумерации пикселей в плоскости ( x 1 , x 2 ) по ( м 1 , м 2 ) максимумы в местоположении (m1 *, m2 *) равны найдено из условий Iref ″ (m1 *, m2 *)> Iref ″ (m1 * ± 1, m2 * ± 1) и Iref ″ (m1 *, m2 *)> t mean (Iref ″).Коэффициент t обычно должен быть установлен в пределах от 0,5 до 2.

    4. Удалите максимумы, расположенные слишком близко друг к другу, чтобы избежать отслеживания похожих объектов более одного раза. Мы исключаем пики яркости, которые находятся на расстоянии менее пикселей от других пиков. Обычно мы выбираем a = 4… 10 пикселей, в зависимости от плотности шариков.

    5. Повышение качества распознавания шариков. Подгонка двумерной параболы к окружению a 2 пикселей вокруг (m1 *, m2 *) помогает определить, принадлежит ли локальный максимум интенсивности флуоресцентному шарику.Эта процедура не является обязательной, но значительно улучшает распознавание бусинок. Целевая функция ‖Iref ″ (m1, m2) −A0 − A1 (m1 − m1 **) 2 − A2 (m2 − m2 **) 2‖ может быть минимизирована аналитически, чтобы быстро получить центр параболы (m1 ** , м2 **). Индивидуальные пики яркости отклоняются, если (m1 **, m2 **) лежит за пределами области a 2 пикселей или если подгонка не выполняется. Результаты ( A 1 , A 2 ) также дают статистические данные о ширине функции рассеяния точки.

    6. Отслеживание смещения реперных маркеров: используйте нефильтрованные изображения ( I ref , I ) для отслеживания. Поместите окна W ref, ci ( m 1 , m 2 ) поверх каждой распознанной кромки на эталонных изображениях из каналов микроскопа c 1 и c 2 Размер окон обычно составляет порядка 15 × 15 пикселей или ≈1 мкм 2 .Все окна нормализуются индивидуально как

      W˜ci (m1, m2) = (Wci (m1, m2) −mean (Wci)) / ‖Wci (m1 ′, m2 ′) — среднее (Wci) ‖.

      Вычислите взаимную корреляцию между всеми опорными окнами W ref, ci ( m 1 , m 2 ) и соответствующими смещенными окнами W ci ( m 1 + b 1 , м 2 + b 2 ) с

      cc (b1, b2) = 12∑i = 1,2∑m1, m2W˜ci (m1 + b1, m2 + b2) W˜ref, ci (m1, m2),

      (20.5)

      где сумма по м 1 , м 2 покрывает только индексы внутри окон. Расположение (b1 *, b2 *) максимума в cc ( b 1 , b 2 ) — это среднее смещение в каждом окне в единицах пикселей. Суммирование по двум каналам приводит к значительно более надежному отслеживанию деформации подложки. Усредняя коэффициенты корреляции, а не сами окна, мы избегаем смешивания членов в кросс-корреляции.

    7. Вычислить смещения субпикселей: Подгонка двумерного гауссова уравнения к максимуму корреляционной матрицы cc ( b 1 , b 2 ) дает оценку положения максимума субпикселей. Это положение принимается за смещение борта. Формулы для подбора двумерных гауссианов можно найти в другом месте (Nobach & Honkanen, 2005).

    20.2.4 РАСЧЕТ ТЯГОВЫХ СИЛ С РЕГУЛЯРИЗОВАННОЙ ТЯГОВОЙ ЦИТОМЕТРИЕЙ ФУРЬЕ

    Наиболее распространенные методы восстановления тяги основаны на справедливости нескольких допущений.Хотя эти предположения не являются необходимыми a priori , они делают вычислительную процедуру легко управляемой. При проведении экспериментов следует учитывать следующие моменты:

    1. Подложка TFM имеет бесконечно большую толщину, а ее поперечная деформация незначительна по сравнению с толщиной геля. На практике это означает, что для измерения силы тяги следует использовать гели ПАК толщиной 30 мкм или более (Boudou, Ohayon, Picart, Pettigrew, & Tracqui, 2009; Merkel, Kirchgessner, Cesa, & Hoffmann, 2007).Смещение гранул на поверхности геля не должно превышать 1 мкм. В противном случае на результат могут влиять геометрические и материальные нелинейности, а также конечная глубина геля.

    2. Силы, нормальные к поверхности подложки, очень малы. Хотя вертикальный компонент тягового усилия можно измерить (Delanoë-Ayari, Rieu, & Sano, 2010; Koch, Rosoff, Jiang, Geller, & Urbach, 2012; Legant et al., 2013), это предположение справедливо для большинства адгезивные типы клеток.Однако, поскольку этими силами пренебрегают, следует следить за тем, чтобы анализировались только хорошо разложенные и плоские ячейки.

    3. Предполагается, что поле смещения на изображении является результатом только ячейки в поле зрения. Нарушения вне поля зрения должны быть незначительными. Чтобы восстановить силы тяги, создаваемые листом клеток, можно использовать другие алгоритмы (Liu et al., 2010; Maruthamuthu, Sabass, Schwarz, & Gardel, 2011; Ng et al., 2012; Tambe et al., 2013).

    20.2.4.1 Вычислительная процедура

    Далее мы шаг за шагом объясним, как продолжить реконструкцию тракции с помощью регуляризованной цитометрии тракции с преобразованием Фурье (Reg-FTTC). Мы призываем читателей, испытывающих трудности с внедрением, обращаться к авторам:

    1. Поле смещения, определенное на предыдущих шагах (раздел 20.2.3), будет состоять из неравномерно расположенных мест валиков и смещений этих валиков. Для последующего использования с БПФ нерегулярное поле должно быть интерполировано на прямоугольную регулярную сетку, покрывающую все изображение.Используйте, например, функцию «griddata ()» в MATLAB. Узлы сетки в позиции ( x 1 , x 2 ) пронумерованы парой ( n 1 , n 2 ) целых чисел n i ∈ [ — ( N i /2 — 1)… N i /2], где N i — четное число узлов.

    2. Создайте дискретные волновые векторы для преобразования Фурье как k i = 2π n i / (d N i ).Здесь d — узловое расстояние сетки в пикселях.

    3. Используйте БПФ для получения дискретного преобразования Фурье u˜i (k1, k2) поля смещения u i ( n 1 , n 2 ). Все данные и результаты являются действительными числами. Поскольку дискретное преобразование Фурье любой действительной величины удовлетворяет условию g˜ (k) = g˜ * (- k), у нас есть только N i /2 + 1 независимых мод Фурье в каждой из двух координат плоскости.

    4. Построить матрицу преобразованной Фурье функции Грина.

      G˜ij (k1, k2, x3) = 2 (1 + s) ex3k12 + k22E (k12 + k22) 3/2 ((k12 + k22) δij − kikj (s − x3k12 + k222)).

      (20,6)

      Общее смещение всего геля на изображении соответствует моде ( k 1 = 0, k 2 = 0). Предположение, что все источники тяги находятся в поле зрения, позволяет избежать расхождения функции Грина, задав G˜ij (0,0, x3) = 0.Эта функция Грина также зависит от вертикального положения x 3 плоскости изображения, где были измерены смещения.

      Затем построим матрицу M˜ij (k1, k2) для любого выбранного параметра регуляризации λ как

      M˜ij (k1, k2) = ∑l (∑mG˜ml (k1, k2) G˜mi (k1, k2) + λ2δil) −1G˜jl (k1, k2).

      (20.7)

    5. Вычислите тягу в пространстве Фурье как f˜i (k1, k2) = ∑jM˜ij (k1, k2) u˜j (k1, k2). Простое матричное умножение определяет фурье-компоненты тяги.

    6. Преобразуйте результат в реальное пространство с помощью обратного БПФ. В MATLAB здесь может использоваться команда «ifft2 (…,« симметричный »)». Результат: f i ( n 1 , n 2 ), представляет собой дискретное поле значений силы тяги, которое распространяется по всему изображению.

    20.2.4.2 Выбор параметра регуляризации

    Параметр регуляризации Тихонова λ в Reg-FTTC может быть определен в рамках теории Байеса (Gelman, Carlin, Stern, & Rubin, 2003) путем сравнения с максимумом a posteriori (MAP) оценка тяги.Априорное распределение вероятностей для f i , а также распределение вероятностей для шума в u i , является выпуклой функцией, которая может быть аппроксимирована гауссианами с дисперсиями α 2 и ξ 2 , соответственно. Распределение апостериорной вероятности можно рассчитать по закону Байеса как

    P ({f} | {u}) = P ({u} | {f}) P ({f}) P ({u}) ~ e − ∑ {x1, x2} (‖ui − ui ( {f}) ‖2) / ζ2e − ∑ {x1, x2} ‖fi‖2 / α2.

    (20,8)

    Минимизация уравнения.(20.4) соответствует максимизации апостериорной вероятности, уравнение. (20,8); когда

    оценка MAP f i , таким образом, дает оценку оптимального параметра регуляризации λ. При стандартном отклонении измерения ξ 0,17 пикселей, 90-кратном эффективном увеличении (60-кратное увеличение и 1,5-кратное промежуточное увеличение, размер пикселя составляет 70 нм) и типичном значении тяги α ≅ 130 Па (), мы находим λ ≅ 10 −4 мкм / Па. Параметры регуляризации оцениваются по формуле.(20.9) обычно дают достаточно гладкое тяговое поле с высоким разрешением.

    Выбор параметра регуляризации. (A) Гистограмма ошибки смещения, полученная путем отслеживания шариков в области, где не происходит деформации геля. Пунктирная линия соответствует гауссовской аппроксимации. (B) Гистограмма симметричной тяги в направлениях x 1 и x 2 . Данные были собраны с участков адгезии и их непосредственной близости в одной ячейке. Подгонка по Гауссу (пунктирная линия) позволяет оценить предварительное распределение тяги.(C) Пример зависимости общей величины тяги от параметра регуляризации.

    демонстрирует, что норма общей тяги резко снижается при увеличении параметра регуляризации. Эвристически λ следует выбирать как можно более низким, но из диапазона параметров, при котором общая величина тяги начинает становиться независимой от параметра регуляризации (критерий L-кривой) (Schwarz et al., 2002). В качестве альтернативы можно использовать передовые методы, которые обеспечивают значение для λ на основе заданных предположений о лежащем в основе шума, например, метод непредвзятой прогнозной оценки риска (Mallows, 1973).Рекомендуется выбрать одно значение λ и оставить это значение фиксированным при сравнении разных ячеек в одинаковых условиях.

    20.2.4.3 Снижение спектральной утечки из-за БПФ

    Часто наблюдаемый артефакт — это образование «псевдонимов» на краю изображения. Такие артефакты возникают в результате утечки спектра, которая возникает при дискретных преобразованиях Фурье, когда данные непериодичны. Проблема может быть эффективно решена путем добавления столбцов и строк нулей вокруг измеренного двумерного поля в пространстве ( x 1 , x 2 ).Такое искусственное расширение окна измерения называется заполнением нулями. Однако мы обнаружили, что заполнение нулями не следует использовать, когда x 3 0.

    20.2.5 ПРЕДСТАВЛЕНИЕ И ОБРАБОТКА ДАННЫХ TFM

    20.2.5.1 Пространственные карты величины силы тяги

    Обычно представлены наборы данных в виде тепловой карты величины тяги (). Здесь норма нанесена разными цветами. В качестве альтернативы, норма тяги также может быть отображена линейно на яркости одного цвета.Такой подход позволяет напрямую строить график сигнала флуоресценции клеточных компонентов вместе с тракцией.

    Количественная оценка тяговых сил, оказываемых отдельными очаговыми адгезиями на субстрате TFM. Клетки аденокарциномы молочной железы человека (MDA-MB-231) трансфицировали eGFP-паксиллином, меченным N-концом, и высевали на субстрат TFM 8,6 кПа, меченный красными и далекими красными флуоресцентными наночастицами. (A) Конфокальные изображения фокальных спаек, меченных eGFP-паксиллином. Шкала шкалы = 5 мкм. (B) Положения дальних красных флуоресцентных наночастиц, встроенных в гель PAA, в напряженном (красный) и ненапряженном (зеленый) состояниях.Край ячейки обведен белым. (C) Поле смещения гранул, отображаемое как цветной векторный график, наложенный на изображение с инвертированным контрастом eGFP – паксиллина. Красный и зеленый векторы указывают на боковое смещение красных и дальних красных флуоресцентных наночастиц из ненапряженного положения соответственно. Масштабный вектор составляет 1 мкм. (D) Поле вектора тягового напряжения, наложенное на инвертированное контрастное изображение eGFP – паксиллина. Масштабный вектор составляет 1 пН. (E) Цветная тепловая карта восстановленного тягового напряжения на ECM с очагами спаек, обведенными черным.Край ячейки обведен белым.

    20.2.5.2 Сцепление целиком

    Среднее значение силы сцепления всегда равно нулю по конструкции. Однако дипольный момент силы и более высокие моменты силы могут быть извлечены из поля тяги (Butler et al., 2002). Эволюция этих моментов может дать информацию о динамике мигрирующих клеток.

    Общая сила ячейки может быть определена количественно через медианное значение силы тяги. Гистограммы величины тяги дают четкие визуальные критерии прочности ячеек.Альтернативным показателем общей прочности ячейки является полная энергия деформации, которая определяется выражением

    U = l22∑n1, n2∑i = 12fi (n1, n2) ui (n1, n2),

    (20.10)

    где l 2 — квадрат узлового расстояния в прямоугольной сетке в мкм 2 . Энергия деформации также включает информацию о том, насколько клетка способна деформировать субстрат. Следовательно, U может быть полезен, если нужно сравнить поведение ячеек на подложках с разной жесткостью.Однако, несмотря на то, что она является интегральной величиной, квадратичная зависимость U от данных измерений делает эту величину склонной к ошибкам измерения. Этот недостаток можно несколько смягчить, ограничив сумму n 1 , n 2 областью прикрепленной клетки и ее непосредственным окружением.

    20.2.5.3 Тяга по заданной линии

    По аналогии с обычным кимографом, изменение тяги по заданным одномерным координатам может быть нанесено на график с течением времени для количественной оценки движения положения пика тяги в пределах отдельных спаек (Плотников и др., 2012). Эти графики могут быть созданы следующим образом: Во-первых, нарисуйте линии, вдоль которых должна быть записана тяга, с помощью команды MATLAB «getline ()». Затем разделите линии на сегменты длиной d ′ пикселей. d ′ можно выбрать равным размеру ячейки d . Наконец, запишите среднее сцепление и флуоресценцию в области площадью d 2 в каждом сегменте.

    СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

    • Aratyn-Schaus Y, Gardel ML. Временное фрикционное скольжение между интегрином и внеклеточным матриксом в фокальных адгезиях при напряжении миозина II.Текущая биология. 2010; 20: 1145–1153. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Аратин-Шаус Ю., Оукс П.В., Стрикер Дж., Винтер С.П., Гардель М.Л. Подготовка матриц жалоб для количественной оценки клеточного сокращения. Журнал визуализированных экспериментов. 2010; 14: 2173. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Balaban NQ, Schwarz US, Riveline D, Goichberg P, Tzur G, Sabanay I, et al. Узел силы и фокальной адгезии: тесная взаимосвязь изучается с использованием эластичных подложек с микрорельефом.Природа клеточной биологии. 2001; 3: 466–472. [PubMed] [Google Scholar]
    • Бенинго К.А., Дембо М., Каверина И., Малое СП, Ван Ю.Л. Возникающие фокальные спайки ответственны за создание сильных движущих сил в мигрирующих фибробластах. Журнал клеточной биологии. 2001; 153: 881–888. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Бенинго К.А., Ван Ю.Л. Гибкие субстраты для определения силы растяжения клеток. Тенденции в клеточной биологии. 2002; 12: 79–84. [PubMed] [Google Scholar]
    • Boudou T, Ohayon J, Picart C, Pettigrew RI, Tracqui P.Нелинейные упругие свойства полиакриламидных гелей: значение для количественной оценки клеточных сил. Биореология. 2009; 46: 191–205. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Butler JP, Tolić-Nørrelykke IM, Fabry B, Fredberg JJ. Поля тяги, моменты и энергия деформации, которые клетки воздействуют на свое окружение. Американский журнал физиологии. Клеточная физиология. 2002; 282: C595 – C605. [PubMed] [Google Scholar]
    • Delanoë-Ayari H, Rieu JP, Sano M. 4D микроскопия силы тяги выявляет асимметричные корковые силы в мигрирующих клетках диктиостелия.Письма с физическим обзором. 2010; 105: 248103. [PubMed] [Google Scholar]
    • Дембо М., Оливер Т., Исихара А., Якобсон К. Визуализация тяговых напряжений, создаваемых движущимися клетками, с помощью метода эластичного субстрата. Биофизический журнал. 1996; 70: 2008–2022. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Dembo M, Wang YL. Напряжения на границе раздела клеток и субстратов во время движения фибробластов. Биофизический журнал. 1999; 76: 2307–2316. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Discher DE, Janmey PA, Wang YL.Тканевые клетки чувствуют жесткость своего субстрата и реагируют на нее. Наука. 2005; 310: 1139–1143. [PubMed] [Google Scholar]
    • DuFort CC, Paszek MJ, Weaver VM. Уравновешивающие силы: архитектурный контроль механотрансдукции. Обзоры природы Молекулярная клеточная биология. 2011; 12: 308–319. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Flanagan LA, Ju YE, Marg B, Osterfield M, Janmey PA. Ветвление нейрита на деформируемых подложках. Нейроотчет. 2002; 13: 2411–2415. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Gardel ML, Sabass B, Ji L, Danuser G, Schwarz US, Waterman CM.Напряжение тракции в очаговых спайках двухфазно коррелирует со скоростью ретроградного потока актина. Журнал клеточной биологии. 2008; 183: 999–1005. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Гельман А., Карлин Дж. Б., Стерн Х. С., Рубин Д.Б. Байесовский анализ данных. 2-й. Чепмен и Холл / CRC; 2003. [Google Scholar]
    • Харрис А.К., Уайлд П., Стопак Д. Силиконовые каучуковые субстраты: новая морщина в изучении передвижения клеток. Наука. 1980; 208: 177–179. [PubMed] [Google Scholar]
    • Эрант М., Дембо М.Cytopede: трехмерный инструмент для моделирования подвижности клеток на плоской поверхности. Журнал вычислительной биологии. 2010; 17: 1639–1677. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Иноуэ С., Спринг К. Видеомикроскопия: основы (язык науки) 2-е. Нью-Йорк: Спрингер; 1997. [Google Scholar]
    • Koch D, Rosoff WJ, Jiang J, Geller HM, Urbach JS. Сила на периферии: биомеханика конуса роста и реакция жесткости субстрата в нейронах периферической и центральной нервной системы.Биофизический журнал. 2012; 102: 452–460. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Kraning-Rush CM, Carey SP, Califano JP, Reinhart-King CA. Количественная оценка тягового напряжения в прикрепленных клетках. Методы клеточной биологии. 2012; 110: 139–178. [PubMed] [Google Scholar]
    • Ландау Л.Д., Лифшиц Е.М. Теория упругости: Вып. 7 конечно по теоретической физике. Лондон: Пергамон; 1959. [Google Scholar]
    • Ли Дж., Леонард М., Оливер Т., Исихара А., Якобсон К. Сила тяги, создаваемая движущимися кератоцитами.Журнал клеточной биологии. 1994; 127: 1957–1964. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Legant WR, Choi CK, Miller JS, Shao L, Gao L, Betzig E, et al. Многомерная микроскопия силы тяги выявляет вращательные моменты вне плоскости вокруг фокальных спаек. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 2013; 110: 881–886. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Legant WR, Miller JS, Blakely BL, Cohen DM, Genin GM, Chen CS. Измерение механической тяги, оказываемой клетками в трехмерных матрицах.Методы природы. 2010; 7: 969–971. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Лю З., Тан Дж.Л., Коэн Д.М., Ян М.Т., Сниадецки Н.Дж., Руис С.А. и др. Сила механического натяжения регулирует размер межклеточных переходов. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 2010; 107: 9944–9949. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Mallows C. Некоторые комментарии к Cp. Технометрика. 1973; 15: 661–675. [Google Scholar]
    • Maruthamuthu V, Sabass B, Schwarz US, Gardel ML.Сила тяги клетка-ECM модулирует эндогенное натяжение межклеточных контактов. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 2011; 108: 4708–4713. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Меркель Р., Кирхгесснер Н., Цеза К.М., Хоффманн Б. Силовая микроскопия клеток на эластичных слоях конечной толщины. Биофизический журнал. 2007. 93: 3314–3323. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Ng MR, Besser A, Danuser G, Brugge JS. Жесткость субстрата регулирует зависимую от кадгерина коллективную миграцию посредством сократимости миозина-II.Журнал клеточной биологии. 2012; 199: 545–563. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Нобах Х., Хонканен М. Двумерная гауссова регрессия для оценки субпиксельного смещения в велосиметрии изображения частиц или оценки положения частицы в велосиметрии с отслеживанием частиц. Эксперименты с жидкостями. 2005; 38: 511–515. [Google Scholar]
    • Оукс П.В., Бекхэм Ю., Стрикер Дж., Гардель М.Л. Напряжение требуется, но его недостаточно для созревания очаговой адгезии без шаблона напряженных волокон.Журнал клеточной биологии. 2012; 196: 363–374. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Pawley J. Справочник по биологической конфокальной микроскопии. 3-й. Springer; 2006. [Google Scholar]
    • Плотников С.В., Пасапера А.М., Сабасс Б., Уотерман С.М. Колебания силы внутри фокальных спаек опосредуют определение жесткости ECM, чтобы направлять направленную миграцию клеток. Клетка. 2012; 151: 1513–1527. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Sabass B, Gardel ML, Waterman CM, Schwarz US. Тяговая силовая микроскопия высокого разрешения, основанная на экспериментальных и вычислительных достижениях.Биофизический журнал. 2008. 94: 207–220. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Schwarz US, Balaban NQ, Riveline D, Bershadsky AD, Geiger B, Safran SA. Расчет сил в очаговых адгезиях на основе данных об упругой подложке: влияние локализованной силы и необходимость регуляризации. Биофизический журнал. 2002; 83: 1380–1394. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Сен С., Энглер А.Дж., Discher DE. Матричные напряжения, индуцированные клетками: вычисление того, насколько далеко клетки могут чувствовать. Клеточная и молекулярная биоинженерия.2009; 2: 39–48. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Tambe DT, Croutelle U, Trepat X, Park CY, Kim JH, Millet E, et al. Микроскопия напряжения монослоя: ограничения, артефакты и точность восстановленных межклеточных напряжений. PLoS One. 2013; 8: e55172. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Waterman-Storer CM. Анализ подвижности микротрубочек-органелл. В: Bonifacino JS, Dasso M, Harford JB, Lippincott-Schwartz J, Yamada KM, редакторы. Текущие протоколы в клеточной биологии.Джон Вили и сыновья; 2001. [Google Scholar]
    • Webb DJ, Donais K, Whitmore LA, Thomas SM, Turner CE, Parsons JT, et al. Передача сигналов FAK-Src через паксиллин, ERK и MLCK регулирует разборку адгезии. Природа клеточной биологии. 2004. 6: 154–161. [PubMed] [Google Scholar]
    • Wirtz D, Konstantopoulos K, Searson PC. Физика рака: роль физических взаимодействий и механических сил в метастазировании. Обзоры природы Рак. 2011; 11: 512–522. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Ян З., Лин Дж. С., Чен Дж., Ван Дж. Х.Определение полей смещения субстрата и тяги клеток — новый подход. Журнал теоретической биологии. 2006; 242: 607–616. [PubMed] [Google Scholar]
    • Йунг Т., Жорж П.К., Фланаган Л.А., Марг Б., Ортис М., Фунаки М. и др. Влияние жесткости субстрата на морфологию клеток, структуру цитоскелета и адгезию. Подвижность клеток и цитоскелет. 2005; 60: 24–34. [PubMed] [Google Scholar]

    Произошла ошибка при настройке вашего пользовательского файла cookie

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


    Настройка вашего браузера на прием файлов cookie

    Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

    • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
    • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
    • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
    • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
    • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

    Почему этому сайту требуются файлы cookie?

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


    Что сохраняется в файле cookie?

    Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

    Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

    Антимусульманский веб-сайт, признанный «унизительным», отказал в регистрации товарного знака

    Блогер-активист Памела Геллер называет решение против предложенного ею товарного знака «неконституционным».«

    Федеральный апелляционный суд оставил в силе решение об отказе в использовании товарного знака для баннера веб-сайта, поскольку это может быть воспринято как пренебрежительное по отношению к мусульманам.

    Апелляционный суд Федерального округа США оставил в силе решение Управления по патентам и товарным знакам США от 2011 года против «Остановить исламизацию Америки» — решение, вызывающее конституционные опасения.

    Это был не первый случай, когда регулирующие органы по товарным знакам применяли малоизвестный раздел закона, который позволял им отказывать в выдаче товарного знака, если он пренебрегает «живыми или мертвыми» или учреждениями, убеждениями или национальными символами или подвергает их «неуважению, неуважению, неуважению. или дурная репутация.«

    Однако оговорка о пренебрежении редко применяется. Один из последних случаев был в 2010 году, когда ливанская компания Arak Corp. пыталась зарегистрировать KHORAN как торговую марку алкогольных напитков.

    Апелляционный суд отметил во вторник, что комментарии и эссе на сайте sioanline.com и других, управляемых активисткой Пэм Геллер, были против мечетей в Соединенных Штатах и ​​поддерживали людей, чтобы они отказались от своей мусульманской веры. (Сайт больше не загружается.)

    Геллер, выступивший против мечети возле Всемирного торгового центра, назвал это постановление «полной побелкой».«Но апелляционный суд заявил, что существуют« существенные доказательства »(PDF) того, что Геллер выступал за« подавление исламской веры ».

    Реклама

    Юджин Волох, ученый-юрист из Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе, сказал, что его «предварительное» мнение по этому поводу состоит в том, что исключение товарных знаков для брендов, которые унижают достоинство, является неконституционным.

    Регистрация товарных знаков, как мне кажется, — это программа государственных льгот, открытая для широкого круга выступающих, не имеющих достаточной оценки качества.Как и другие подобные программы (такие как широко доступные программы финансирования, налоговые льготы или доступ к государственной собственности), ее следует рассматривать как форму «ограниченного общественного форума», в котором правительство может устанавливать ограничения на основе содержания, но не точку зрения. на основе. Исключение оценок, которые унижают группы, в то время как допускаются оценки, восхваляющие эти группы, кажется мне дискриминационным по точке зрения. Но я не уверен, что суды в конечном итоге будут рассматривать это по-моему; пока они не были склонны делать это именно потому, что исключение знака из федеральной регистрации оставляет людям полную свободу использовать знак.

    Эффект от решения, однако, имеет иронический оттенок.

    Волох заявил, что в решении отвергается «особая правовая защита, предлагаемая зарегистрированным товарным знакам, такая как более легкое запрещение третьим сторонам использовать зарегистрированный товарный знак в коммерческих целях».

    Геллер заявила, что намерена обжаловать «неконституционное» решение.

    Она сказала, что это решение подчеркивает, «как федеральное правительство, и особенно суды, продолжают отказываться от поклонения и умиротворения мусульманской чувствительности», и добавила, что товарный знак был запрещен, потому что власти США «опасаются реакции сторонников исламского превосходства».«

    Фермеры страуса эму сохраняют надежду на будущее промышленности

    Фред Биас купил пару страусов эму шесть лет назад, надеясь развести крупных нелетающих птиц на своей ферме в Южном Мэриленде и заработать на том, что, по его мнению, могло бы удовлетворить спрос на экзотику. Нежирное красное мясо австралийского существа и масло.

    Он предполагал, что по мере того, как государственные и национальные отраслевые группы сообщат об этом, заказы будут поступать из супермаркетов и ресторанов США, жаждущих мяса.Компании, работающие в сфере здравоохранения и красоты, потребуют масла.

    Но до сих пор эму Биаса проигрывали: вложив 40 000 долларов в ограждение, электричество, инкубаторы и другое оборудование для своей фермы эму в округе Чарльз, он не смог продавать мясо в рестораны и супермаркеты. По его словам, Биас, руководитель программы Федерального управления гражданской авиации, продает стейки эму и гамбургеры эму друзьям и коллегам по ценам, не покрывающим его издержки. Половина мяса нежелательно ложится в морозилку.

    Смещение сказал, что большинство фермеров страуса эму ошибочно полагали, что мясо будет настолько популярным, что птицы будут продавать себя. Таким образом, он работает над планом, чтобы вырезать нишу для своих птиц и, в конечном итоге, заработать деньги: хот-доги эму, которые он хотел бы продать государственным школам округа Чарльз.

    «Одни только школы округа Чарльз могли использовать все эму, которые есть у нас в Мэриленде», — сказал он. «Если это не сработает, мы вышли из бизнеса».

    С момента пика повального увлечения эму в начале 1990-х, несколько U.S. инвесторы получили прибыль от своей игры. Как и Биас, многие из примерно 150 фермеров страуса эму, оставшихся в Мэриленде и Вирджинии, находятся в затруднительном положении. Но те, кто остается, сосредоточены на том, чтобы превратиться из наивных инвесторов в прибыльных маркетологов.

    Маркетинговый кооператив страусов эму в Вирджинии, созданный два года назад, покупает мясо эму у фермеров по цене 3 доллара за фунт и перерабатывает его в мясные палочки для продажи в магазинах Вирджинии. Кооператив планирует производить летнюю колбасу, колбасу и, возможно, вяленое мясо, и ищет дистрибьютора для более широкого сбыта продукции.

    Ассоциация страусов эму Мэриленда — группа поддержки, насчитывающая около 20 членов, примерно половина членов, которыми она могла похвастаться несколько лет назад, по словам Биаса, — планирует упаковывать и продавать мясо страуса эму под одной этикеткой. А отдельные фермеры, такие как жительница Манассаса Анн Геллер, заключили контракты с небольшими лабораториями на производство продуктов для нишевых рынков, таких как магазины товаров для здоровья и косметики.

    Геллер, которая заплатила 25000 долларов за свою первую пару эму в разгар повального увлечения, наконец рассчитывает получить прибыль в следующем году, после того, как переключила свое внимание с мяса, которое она продает в магазины и рестораны изысканной кухни, на новая линейка масел эму, включая бальзам для губ, увлажняющий крем, мыло, массажное масло и гелевые колпачки.

    «Кто-то на днях зашел купить бутылку масла эму и вышел, потратив 52 доллара», — сказала она. «Быть ​​розничным продавцом — вот в чем все дело».

    Многие фермеры страуса эму видят свое будущее в привлекательно упакованных увлажняющих маслах эму и массажных маслах, а также в мясных палочках, колбасах и «птичьих собачках».

    Александра Холл, фермерка с восточного побережья эму, имеет только один продукт — чистое масло эму. Но она интенсивно сосредоточилась на маркетинге своей продукции, нацелив свой веб-сайт на мужчин с «рабочими руками».«Она называет свою линию, Outback Medic,« спасательное снаряжение для кожи »и украшает бутылки медицинским крестом в камуфляже.

    Хотя фермеры страуса эму видят разные пути к прибыльности, маркетологи говорят, что таким мелким производителям предстоит нелегкая битва.

    «Мысль о том, чтобы съесть такую ​​долговязую птицу, меня не привлекает, поскольку я должен пойти и купить», — сказал Роберт Макмат, президент Центра демонстрации новых продуктов и обучения в Итаке, штат Нью-Йорк. «Нефть — тоже проблема.Есть люди, которые не хотят, чтобы их продукты тестировались на животных, и они не захотят, чтобы в продуктах были животные ».

    « Вы должны получить Elizabeth Arden, или Proctor & Gamble, или одну из — сказал МакМат, — крупные компании, у которых есть большие карманы, чтобы выпускать ваш продукт. «Даже в этом случае рост займет много времени». его фирма ожидает прибыли в размере 16 миллионов долларов в следующем году в основном потому, что она сохранила небольшую линейку продуктов и нацелила свои маркетинговые усилия.

    В дополнение к обычному маслу эму, Dermalay предлагает противовоспалительный лосьон от боли в мышцах и суставах под названием «Powerheat» и крем для тела от сухой кожи, экземы и ожогов.

    Продаваемая по всей стране медицинским и аптечным дистрибьюторам США, эта продукция также доступна покупателям через каталоги. Эдвардс ожидает, что Dermalay скоро заключит сделки с телевизионными торговыми сетями и крупными косметическими компаниями и производителями товаров для здоровья.

    Геллер сказал, что наибольший рыночный потенциал продуктов эму — это медицинская промышленность.Недавно она запланировала демонстрацию противожогового потенциала масла эму в больнице принца Уильяма и продала свой продукт отдельным врачам для лечения экземы.

    Она ожидает, что специалисты в области здравоохранения будут все чаще использовать масло эму для самых разных целей, в том числе в качестве пищевых добавок, содержащих 29 незаменимых жирных кислот, сказал Геллер.

    Фермеры страуса эму также ищут способы рационализировать свою работу, продвигая законодательство, чтобы сделать инспекцию мяса страуса эму в Министерстве сельского хозяйства США обязательной, чтобы фермерам не пришлось платить за инспекцию.Такое изменение могло бы сократить стоимость каждого фунта мяса на 1 доллар или около того.

    Хотя такие новые способы мышления оживили деловые перспективы фермеров страуса эму, терпение и вера по-прежнему являются теми силами, которые поддерживают их работу.

    «Если я думаю о том, где мы могли бы быть в финансовом отношении, если бы мы не вышли на рынок страуса эму, меня просто тошнит», — сказал Геллер. «Тем не менее, я продолжаю возвращаться к своему чутью, что эму могут так много предложить».

    Страус эму: другое красное мясо

    Фермеры страуса страуса эму ждут, когда их продукт станет популярным среди потребителей.Мясо эму по вкусу и текстуре похоже на нежирную говядину, но с меньшим содержанием холестерина, жира и калорий, а также с большим содержанием железа и белка. Масло страуса эму имеет множество применений.

    Анализ Emu Говядина Индейка Цыпленок

    Белок 23 г 19,9 г 22,3 г 23,1 г

    Калорий 120225104110

    Натрий 40 мг 55 мг 61 мг 65 мг

    Железо 4,5 мг 2,1 мг 1,4 мг 0,7 мг

    Холестерин 45 мг 65 мг 73 мг 64 мг

    Жиры 3 г 15,6 г 1,6 г 1,2 г

    Насыщенные жиры 1 г 7.2 г 0,7 г 0,3 г

    Физические характеристики: нелетающая птица с коричнево-черными перьями.

    Рост: до шести футов в высоту.

    Вес: может весить до 110 фунтов.

    Среда обитания: Население полузасушливых равнин Австралии.

    Диета: ягоды, фрукты, зерно, травы, насекомые.

    Размножение: Самка обычно откладывает кладку из 9-20 темно-зеленых яиц, которые самец инкубирует около 60 дней. Яйца размером 5,5 дюйма и весом 1,5 фунта.При вылуплении птенцы достигают 14 дюймов в высоту. Самец кормит и защищает птенцов около 7 месяцев.

    Продолжительность жизни в дикой природе: от пяти до 10 лет.

    Скорость: Может достигать путевой скорости 30 миль в час; также хорошие пловцы.

    Масло страуса эму находит широкое применение, включая косметику, мыло и шампуни. Масло эму также имеет лечебные свойства как противовоспалительное средство, которое может уменьшить отек и жесткость суставов, синяки и мышечные боли.

    ИСТОЧНИК: Американская ассоциация страусов эму.

    НАЗНАЧЕНИЕ: Некоторые фермеры страусов эму предполагали, что мясо будет настолько востребовано, что нелетающие птицы будут продавать себя.

    Эпизод «ДРУЗЬЯ» со всеми предложениями по книгам

    Этот контент содержит партнерские ссылки. Когда вы совершаете покупку по этим ссылкам, мы можем получать партнерскую комиссию.

    Мы пересматривали друзей у меня дома. Мы отыграли первые два сезона, где у всех много геля в волосах и несколько выдающихся модных решений девяностых, а сейчас мы находимся на середине третьего сезона. Ричард и Моника согласились быть просто друзьями, Росс и Рэйчел На перерыве, и Джоуи пробует новые варианты чтения.Поскольку Little Women выглядит так, будто он не выйдет из морозилки в ближайшее время (хотя Бет не умирает * все *), ему скоро понадобится новое чтение — и, как всегда, мы стремимся доставить удовольствие . Вот список рекомендуемых книг для всех основных персонажей Friends . Будьте сами себе ветрогенератором!

    Джои Триббиани

    Джоуи — сложный парень. Вроде, как бы, что-то вроде. Он также парень со скрытой глубиной, который на самом деле довольно хорошо начитан, будучи поклонником как «Сияние» Стивена Кинга, так и «Невыносимой легкости бытия» Милана Кундеры.Любое предложение по чтению для Джоуи должно учитывать все это, а также служить источником вдохновения для его следующего приема пищи …

    Рекомендация :

    Это должно быть вместе: наша поваренная книга сообщества, книга, которая позволит Джоуи есть и одновременно творить добро. Дом Together , созданный жителями Западного Лондона, пострадавшими от пожара в башне Гренфелл, прославляет еду, дружбу и надежду. Вся прибыль от продажи этой книги идет на кухню Hubb Community Kitchen.

    Информационный бюллетень

    Подпишитесь на нашу рассылку Book Deals и получите скидку до 80% на книги, которые вы действительно хотите читать.

    Спасибо за регистрацию! Следите за своим почтовым ящиком.

    Регистрируясь, вы соглашаетесь с нашими условиями использования

    Рэйчел Грин

    Страстная фанатка «Маленьких женщин» Луизы М. Олкотт, но не слишком увлеченная литературным классом, Рэйчел Грин представляет собой загадку. По мере развития сериала она становится талантливой деловой женщиной и матерью, в то время как носит одни из самых причесок на телевидении.Книга для Рэйчел должна быть чем-то, что удерживает ее внимание, может уместиться в ее сумке, а также вписаться в ее напряженную жизнь. Если это помешает ей расстаться с Россом, это тоже плюс.

    Рекомендация:

    «Маленькие лидеры: дальновидные женщины во всем мире», рассказывающие историю таких женщин, как Фрида Кало и Ада Лавлейс, — это история женщин, которые изменили мир. Это идеальная книга для женщины, которая изменила свой мир и хочет передать эту силу своей дочери.Кроме того, он великолепно иллюстрирован и должен вдохновить Рэйчел на ее карьеру.

    Чендлер Бинг

    О. Мой. GAWD. Независимо от того, случайно ли он встречает Дженис в пятнадцатый раз или делает душераздирающе красивые предложения Монике, Чендлер Бинг — человек контрастов. Он слишком нетерпелив, чтобы обнаружить финал «Маленького паровоза, который мог», но он будет рыскать по магазинам в поисках красивой копии «Вельветового кролика». Любая книга для Чендлера должна отражать все это и его умение вытаскивать шутки из воздуха.

    Рекомендации:

    «

    » Роберта Уэбба «Как не быть мальчиком» — идеальная книга для чтения для любого парня, не говоря уже о том, кто побывал в том же путешествии, что и Чендлер. Думаю, ему также понравилась бы «Книга кроличьих самоубийств», пока он прячется в ванной вдали от детей.

    Моника Геллер

    Моника — женщина, которая знает свое мнение. Будь то складывание зефира в концентрические круги или возможность убрать свой путь в любой чрезвычайной ситуации, она сделает все возможное для вас и позаботится о том, чтобы вы хорошо поели.Младшая и часто затененная сестра Росс, любая книга для Моники должна отражать ее любовь к друзьям, ее кулинарные навыки и ее соревновательный дух. Это тоже не должно быть стихов.

    Рекомендация:

    Я выбрала «Освоение искусства французской кулинарии» от Джулии Чайлд, так как она подошла бы по всем направлениям. Это не поэзия, и она могла бы подготовиться к чтению книги и приобрести новые навыки, одновременно сравнивая себя со старыми видео Джулии Чайлд на Youtube.Я также выбрал «Грубый путеводитель по Европе с ограниченным бюджетом», поскольку подозреваю, что это вдохновит Монику на рентабельный отпуск на всю жизнь.

    Фиби Баффей

    Фиби Баффей, способная рассказать историю «Ночи перед Рождеством» и случайно нарочно заявить ее, не берет пленных. Она сообщит вам, где вы с ней стоите, не вспотев, и, если вам повезет, она сделает это в песне. Любая книга для Фиби с щедрым, любящим и полностью индивидуальным персонажем должна быть уникальной.

    Рекомендации:

    Фиби может выбрать либо Линкольн в Бардо Джорджа Сондерса, либо «Девушка наполовину сформирована» Эймера Макбрайда. Обе книги стилистически уникальны, нужно немного постараться, чтобы разобраться, но они того стоят.

    Росс Геллер

    Один из клиентов моей маленькой библиотеки на днях сказал мне, что ему нравится читать книги о «ДИНОЗАВРАХ, ДИНОЗАВРАХ, ДИНОЗАВРАХ». Это описание можно легко применить к самому Россу.Но у Росс есть и другие навыки: он неплохо выходит замуж, периодически заводит отношения с Рэйчел и старается делать все возможное для своих друзей. Любая книга для Росса должна заставить его задуматься; он должен быть умным, умным и, возможно, включать рецепт лучшего бутерброда на свете.

    Рекомендации:

    Хотя я и хочу, я не могу выбрать легкий вариант, предлагая «Парк Юрского периода» или «Это не мой динозавр». Вместо этого я собираюсь предложить Россу прочитать «Сэндвич-книгу» Макса — руководство по «созданию совершенства между двумя ломтиками хлеба» — и чередовать это с «Сапиенсом» Ювала Ноя Харари.

    .

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

    Жесткость полиакриламида

    2.3 кПа 4,1 кПа 8,6 кПа 16,3 кПа 30 кПа 55 кПа

    год ° C )

    40% акриламид (мл) 3,75 2,34 2,34 3,00 3,00 2,00 0.75 0,94 1,88 0,75 1,40 2,25
    d H 2 O (мл) 0,5 1,726 0186 1,28 1,726 0,78 906 018 018
    Общий объем (мл) 5 5 5 5 5 5

    Рабочий раствор 9057 9057 (использовать сразу)
  9. 048
  10. Стандартный раствор (мкл) 125 200 200 250 250 333
    Красные флуоресцентные шарики (мкл) 7.5 7,5 7,5 7,5 7,5 7,5
    Флуоресцентные шарики дальнего красного цвета (мкл) 7,5 7,5 7,5 7,5 7,5 10% персульфат аммония (мкл) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5
    TEMED (мкл) 0,75 0,75 0,75 0,75
    dd H 2 O (мл) 357 282 282 232 232 163